检测肿瘤复发的方法技术

本发明专利技术涉及用于检测肿瘤复发的对象特异性方法，该方法以对该对象的肿瘤的克隆/亚克隆突变图谱的认识以及在其无细胞DNA（cfDNA）中的突变的检测为基础，通常通过多重PCR检测肿瘤突变（例如单核苷酸变异（SNV））。

Methods of detecting tumor recurrence

The invention relates to an object-specific method for detecting tumor recurrence, which is based on the recognition of the clonal / subclonal mutation map of the tumor of the object and the detection of mutations in its cell-free DNA (cfdna), and usually detects tumor mutations (e.g. SNV) by multiple PCR.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】检测肿瘤复发的方法
本专利技术涉及用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性方法。
技术介绍
癌症是全球死亡的主要原因，其中肺癌是与癌症相关的死亡率的主要原因。非小细胞肺癌(NSCLC)是最常见的组织学亚型，占肺癌病例的85％至90％。大多数患有NSCLC的患者存在局部进展期疾病或转移性疾病，并且具有不良的预后。即使在可切除的阶段被确诊，仍有高达30％至50％的患者将在术后阶段经历疾病复发。高达40％的经受非小细胞肺癌的手术切除的患者，经历其癌症的复发。目前一些经受手术的患者被提供术后(辅助)化疗或放射治疗，以将肺癌回归的风险降低5-10％。基于患者是否具有与侵袭性肿瘤(即，大肿瘤、淋巴结参与)一致的病理特征以及患者是否足够适合来接受化疗治疗，来提供这样的治疗。化疗后的患者接受“监视”。他们每3-6个月回到诊所，来临床评估肺癌复发的体征，并且他们还接受胸部X-射线或CT扫描。如果存在与其肺癌的复发一致的影像学或临床特征，则他们将被正式调查复发。如果复发的肺癌被确认，则治疗将取决于该复发的肺癌已经扩散至何处。如果肺癌已经在单一位点复发，那么可以实施使用放射疗法或手术的“根治性”治疗来试图实现患者的治愈。如果该癌症在多个位点复发，那么通常提供使用化疗的治疗，并且患者不可能被治愈。如果是这种情况，那么预后通常被限制在1年到18个月。在患有进展期癌症的患者的血浆和血清中可以检测到无细胞DNA(cfDNA)。多种cfDNA图谱的方法正在被构建为临床诊断工具。然而，在早期肺癌中，cfDNA图谱的方法不太成功，并且通常使用通用基因试验组(genepanel)来询问血浆样品。
技术实现思路
本专利技术描述了通过在来自患者血浆的cfDNA中检测患者特异性的克隆和/或亚克隆突变，以非侵入性方式追踪肿瘤复发和转移性亚克隆的特性的“定制”方法。通过进行患者的肿瘤“系统进化树(phylogenetictree)”的模拟，该方法生成了为个体患者所独有的定制的生物标记物图谱。克隆突变本质上存在于肿瘤内的每一个细胞中。通过将克隆突变整合到试验组(panel)中，该方法增加了血浆变异检测的灵敏度。追踪患者的肿瘤“系统进化树”的血浆图谱，能够识别作为/负责对复发疾病进行播种(seed)的在肿瘤内的克隆/亚克隆，开启了这样的机会，即在宏观疾病在影像学上变得明显之前有机会进行介入治疗，并且通过追踪克隆和亚克隆变异的减少来监测对这种治疗的反应。因此，通过追踪患者特异性变异以及通过从患者的系统进化树的躯干中选择代表克隆变异的变异，而不是依赖于可能存在或可能不存在于任何个体患者中的通用标记物的试验组，该方法有利地增加了鉴定血浆变异的灵敏度和特异性。因此，本专利技术涉及在肿瘤(例如肺癌)中进行cfDNA分析的方法，包含追踪患者的疾病进展和/或复发以辅助稳健的治疗方案。该方法尤其适用于在辅助环境中追踪手术切除后的肺癌(非小细胞肺癌)的复发。使用该方法的复发的早期检测，可以促使治疗(包括免疫治疗)的开始或改变治疗，使用相同的方法来追踪这种残留疾病对治疗的反应。该方法还可用于除肺部之外的癌症和/或已经以其他方式被移除的癌症。因此，在本专利技术的第一方面，提供了用于在对象中检测肿瘤复发的对象特异性方法，包括：(a)对对象的肿瘤的基因组或外显子组的全部或一部分进行测序，以定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；(b)定义一组试剂，其将通过所述克隆和/或亚克隆突变的存在，检测来自所述肿瘤的DNA的存在；使用所述一组试剂，分析在肿瘤移除之后从对象中获得的包含来自所述肿瘤的DNA的样品，以通过检测该样品中的所述克隆和/或亚克隆突变来确定所述肿瘤是否已经复发。在本专利技术的另一方面，提供了对象特异性的方法，其定义一组试剂以在该对象中检测肿瘤的复发，包含：(a)对该对象的肿瘤的基因组或外显子组的全部或一部分进行测序；(b)定义在所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；以及定义一组试剂，其将检测在来自所述对象的样品中的所述克隆和/或亚克隆突变的存在。在本专利技术的另一方面，提供了用于在对象中检测肿瘤复发的对象特异性方法，其包含：使用将检测来自所述肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的存在的对象特异性的一组试剂，分析在移除肿瘤后从该对象中获得的样品中的DNA，以通过检测在该样品中来自该肿瘤的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。在本专利技术的另一方面，提供了对象特异性的一组检测试剂，用于在该对象的cfDNA中检测来自肿瘤的克隆和/或亚克隆突变，其通过本专利技术的方法获得或能够通过本专利技术的方法获得。在本专利技术的另一方面，提供了治疗对象的方法，其包含执行本专利技术的方法，其中基于在来自对象的样品中检测到的克隆和/或亚克隆突变，为患者选择治疗。附图说明图1.显示靶标选择、试验设计和血浆PCR的工作流程图。图2.所测量的cfDNA浓度、肿瘤阶段。每个数据点代表一个血浆样品。图3.使用来自患者肿瘤样品的DNA的多重PCR反应的验证。样品示出了在组织VAF测量之间良好的相关性。在单独的方框中示出了每个样品，并且VAF数据点根据组织子部分着色。图4.在每个样品的血浆中检测到的SNV和未检测到的SNV。图5.根据肿瘤分期的在血浆中的SNV检测(左)和样品检测(右)。图6.血浆VAF作为肿瘤分期和SNV克隆性的函数。图7.通过组织学类型在血浆中检测到的SNV的数量。图8.在来自每个样品的血浆中检测到的SNV数量作为cfDNA输入量的函数。图9.血浆中的SNV的检测与其肿瘤中的VAF相关。图10A.读出序列的深度(depthofread)作为所得调用的函数的直方图。图10B.试验的估计的检测极限(limitofdetection)作为所得调用的函数。在每个试验组中，左边组示出了未检测到预期血浆SNV的试验，右边组示出了检测到预期血浆SNV的试验。图11A.评估血浆中检测到的SNV，用于从cfDNA数据中重现肿瘤系统进化树。示出了具有超过10种血浆SNV的样品。具有有效估计的癌细胞分数的血浆中检测到的分支的数量。图11B.评估血浆中检测到的SNV，用于从cfDNA数据中重现肿瘤系统进化树。示出了具有超过10种血浆SNV的样品。SNV对的百分比，其中其血浆VAF值遵循肿瘤系统进化树结构。图12.上图——每个样品的被引物靶向的SNV总数，按驱动种类排序。下图——每个样本被引物靶向的SNV总数，按克隆性排序。图13.表明了基于组织学亚型(鳞状细胞癌(LUSC)和腺癌(LUAD))分类的每位患者检测到的克隆和亚克隆变异的数量的柱状图。被填充的柱表明检测到的变异，未被填充的柱表明探测到的变异数量。图14.与未检测到的肺腺癌(LUAD)相比，检测到的LUAD的有丝分裂活性更高(图14A和图14B)，并且基因组不稳定(图14C)。检测到的LUAD主要是实体组织学亚型(图14D)。图15.克隆SNV具有比亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包含：/na）对对象的肿瘤的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，以定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；/nb）定义一组试剂，所述一组试剂将通过所述克隆和/或亚克隆突变的存在，检测来自所述肿瘤的DNA的存在；/nc）使用所述一组试剂，分析在肿瘤移除之后从所述对象获得的包含来自所述肿瘤的DNA的样品，以通过检测所述样品中的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20161102 GB 1618485.51.一种用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包含：
a）对对象的肿瘤的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，以定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；
b）定义一组试剂，所述一组试剂将通过所述克隆和/或亚克隆突变的存在，检测来自所述肿瘤的DNA的存在；
c）使用所述一组试剂，分析在肿瘤移除之后从所述对象获得的包含来自所述肿瘤的DNA的样品，以通过检测所述样品中的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。


2.一种定义一组试剂以在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包括：
a)对所述对象的肿瘤的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序；
b)定义在所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变；以及
c)定义一组试剂，所述一组试剂将在来自所述对象的样品中检测所述克隆和/或亚克隆突变的存在。


3.一种用于在对象中检测肿瘤的复发的对象特异性的方法，其包含：使用将检测来自所述肿瘤的克隆和/或亚克隆突变的存在的对象特异性的一组试剂，对在肿瘤移除之后从所述对象中获得的样品中的DNA进行分析，以通过在所述样品中检测来自所述肿瘤的所述克隆和/或亚克隆突变，确定所述肿瘤是否已经复发。


4.根据权利要求1或2所述的方法，其中在肿瘤活检上或在来自所述对象的无细胞DNA（cfDNA）、循环肿瘤DNA、外泌体来源的肿瘤DNA或循环肿瘤细胞上实施所述测序，所述肿瘤活检为所述肿瘤的全部或一部分、或所述肿瘤的一个或多个子部分。


5.根据权利要求4所述的方法，其中在移除肿瘤之后在所述肿瘤或其子部分上实施所述测序。


6.根据权利要求1或3所述的方法，其中将被分析的所述样品包含cfDNA、循环肿瘤DNA、外泌体来源的肿瘤DNA或循环肿瘤细胞。


7.根据权利要求1或2所述的方法，其中对所述肿瘤的至少两个子部分的基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，并基于哪些突变发生在哪些肿瘤子部分中来定义克隆和/或亚克隆突变。


8.根据权利要求7所述的方法，其中通过对所述肿瘤的多达10个子部分的基因组或外显子组进行测序，定义所述肿瘤中的克隆和/或亚克隆突变。


9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述克隆和/或亚克隆突变是单核苷酸变异（SNV）突变。


10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一组试剂是一组多重PCR引物，并且所述分析是多重PCR。


11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其还包含合成所述一组试剂。


12.根据权利要求1、2或4-11中任一项所述的方法，其还包含：对所述对象的非肿瘤基因组或外显子组中的全部或一部分进行测序，并将其与所述肿瘤基因组或外显子组序列进行比较，以定义在所述对象的肿瘤中发现的克隆/亚克隆突变。


13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述一组检测试剂检测至少一种或至少两种克隆突变。


14.根据权利要求4-13中任一项所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特·查尔斯·斯旺顿，克里斯多夫·阿波什，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，纳特拉公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB