用于神经肌肉障碍和神经运动障碍的基因疗法制造技术

技术编号:38398394 阅读:34 留言:0更新日期:2023-08-07 11:11
本发明专利技术提供了筛选能够感染受试者的神经元或其亚区室的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法,所述神经元涉及衍生自诱导多能干细胞或胚胎干细胞的神经元。本发明专利技术还提供了AAV衣壳、衣壳编码核苷酸序列、表达载体、病毒颗粒、细胞和试剂盒,其用于在治疗诸如痉挛的神经肌肉障碍或神经运动障碍的方法中使用。从所述方法产生的序列能够产生靶向选择诸如支配肌肉细胞的运动神经元的神经元群体的新的基因疗法,从而提供对于受试者能够是个性化的高特异性。性化的高特异性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于神经肌肉障碍和神经运动障碍的基因疗法


[0001]本专利技术总体上涉及用于筛选靶向确定的神经元群体(如运动神经元)的腺相关病毒(“AAV”)衣壳的方法,所述AAV衣壳可以用于开发用以治疗神经肌肉障碍和神经运动障碍(如痉挛)的基因疗法。

技术介绍

[0002]神经系统障碍和疾病的症状是由脑和脊髓的神经元和回路的异常功能引起的。当前的治疗旨在靶向这种功能障碍,并且包括使用例如深部脑刺激、脊髓刺激或植入装置(如泵)进行局部药物递送的相对较新的功能神经外科领域。这些治疗成功的关键是所植入的装置在神经功能障碍区域中的位置。换句话说,治疗功能障碍的神经元至关重要。
[0003]植入装置的替代方案是插入基因来改变神经元的功能,即“基因疗法”。然而,无论是植入装置还是插入遗传物质,都仍然有特异性的问题:在植入装置的地方有许多不同类型的神经元,其全部会受到影响。
[0004]替代方案是使用专门针对涉及回路功能障碍的神经元的基因疗法。这可以通过组合三个因素来完成:(a)特定于神经元类型的启动子基因;(b)将遗传物质插入回路中的不同位置,即目的神经元投射的地方,使得此材料被转运回神经元细胞体以改变其功能;以及(c)增强病毒对特定神经元类型的趋向性。
[0005]重组腺相关载体(“rAAV”)是用于将遗传物质转移到细胞中的重要载体,并且尤其是在基因疗法应用中使用的主要病毒载体(Li和Sumulski,2020)。目前正在使用几种基于rAAV的基因疗法,如用于治疗脊髓性肌萎缩的Zolgensma和用于治疗视网膜营养不良亚型的Luxtern,并且当前正在临床试验中测试更多的基因疗法。
[0006]AAV是属于依赖细小病毒属(dependoparvovirus)的小病毒,含有单链DNA,可达约4.9Kb。AAV基因组含有三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3,其全部由一条mRNA翻译而来。在自然环境下,已经鉴定出多种AAV血清型,每种血清型都具有独特的衣壳基因序列,因此具有不同的趋向性,尽管野生血清型倾向于能够感染多种组织和细胞类型。这些血清型由数字表示:AAV1、AAV2等。
[0007]经由DNA重组方法对衣壳序列进行修饰可以产生非天然序列,其具有针对(towards或against)特定细胞或组织的定制特性和趋向性,并且逃避免疫系统(Vandenberghe等人,2009)。通常,可以通过两种方式对衣壳进行修饰,即现有衣壳DNA序列的随机诱变,或通过衣壳改组(即从多个衣壳取DNA序列并随机改组序列的部分以制造新的衣壳;Buning等人,2015)。这些方法产生了大量具有潜在有价值的特性的高度多样化的衣壳。当被包装成功能性病毒体时,可以在动物组织或在细胞培养物中对它们进行筛选,以选择靶向特定组织或细胞的衣壳。然后可以从头产生这些衣壳序列,并且在基因疗法中将其与具有治疗潜力的基因组合。
[0008]这种筛选衣壳文库以产生新型基因疗法载体的系统已经在动物中成功应用于AAV9衍生物,其在全身注射后可以穿过血脑屏障并感染神经元。以这种方式产生了诸如
PhP.eB(综述于Bedbrook等人,2018中)的rAAV。在此系统中,将rAAV衣壳文库注射到实验动物中,然后收获靶细胞群体(在这种情况下为神经元)并对其进行测序(通过PCR或通过深度测序方法)以鉴定已经感染这些细胞的AAV衣壳的序列。然后可以从头合成这些序列,并且将其用于进一步的实验或在称为定向进化的过程中对其进行进一步轮次的诱变和筛选(以增加进化压力)(参见Li和Sumulski,2020)。这种类型的方法已经用于产生靶向多巴胺能神经元(Davidsson等人,2019)、横纹肌(Yang等人,2009)和视网膜部分(Dalkara等人,2013)的rAAV。也可以使rAAV衣壳进化以减少其对重要器官(如肝脏)的感染(Pulicherla等人,2011)。最后,rAAV衣壳的定向进化也可以用于靶向单独细胞类型的亚区室。例如,使rAAV2

Retro进化以靶向小鼠皮层神经元的突触末梢(Tervo等人,2016)。
[0009]体内研究已经表明,AAV衣壳的定向进化可以产生具有有用特性的载体,所述有用特性如穿过血脑屏障的能力和增加的向神经性(Deverman等人,2016和EP3044318B1)或针对多巴胺能神经元(Daviddson等人,2019)或心肌细胞(Yang等人,2009)等(关于综述,参见Li和Sumulski,2020)。定向进化涉及产生衣壳文库,即被经由易错PCR、衣壳改组或两者产生的随机衣壳序列衣壳化的AAV载体的混合物。然后将此文库施加至细胞系(例如Maheshri等人,2006)、未分化干细胞(Asuri等人,2012),或最常见地在实验动物中施加(例如Devermann等人,2016;Li和Sumulski,2020;专利US8632764B2;US20170166926A1;US9701984B2)。此外,有来自一个小组的初步报告,该小组使用分化成心肌细胞的iPSC来产生向心性AAV。
[0010]尽管可以通过多种方式产生AAV衣壳文库,但对这些文库的筛选主要依赖于实验动物的使用。这种产生作为有效基因疗法载体的rAAV的方法的一个主要缺点是鉴定出的衣壳通常特定于动物的物种或甚至品系。因此,在筛选宿主(即小鼠)中开发的衣壳的许多改进的特征和功能不会容易地转移到非人灵长类动物和人中(Hordeaux等人,2018)。这可能代表了工程化衣壳尚未在临床和临床前研究中广泛替代野生型变体的主要原因(Davidsson等人,2019)。
[0011]可以如上所述治疗的神经系统障碍或病症的一个例子是痉挛。痉挛是患有多种神经系统障碍的人们所遭受的一种神经系统症状,所述神经系统障碍包括但不限于多发性硬化、卒中、创伤性脑损伤、脊髓损伤和脑瘫。据估计,痉挛影响世界各地约1200万人,其中约22%的患者由于病情而无法工作,几乎所有患者都报告他们的生活质量受到影响,并且约50%的患者报告他们的生活质量受到很大影响。痉挛是由运动神经元使肌肉过度兴奋而引起的,由于所述疾病,肌肉变得“过度兴奋”。
[0012]痉挛的当前治疗涉及口服药物(例如巴氯芬)、肌内注射麻痹剂(肉毒杆菌毒素)或手术插入泵以将药物(例如巴氯芬)直接递送到脊髓液中。口服药物通常是不足的,或者人们遭受显著的不良反应。保妥适(Botox)需要终身每年重复施用几次。保妥适通常只注射在有限数量的肌肉中,并且可能会有长期的不良反应。巴氯芬泵在缓解症状方面可以非常有效,然而,它们具有高度侵入性,因为它们需要手术干预来植入并重新填充,这每年发生2

4次,并且它们必须每6

7年更换一次。此外,在泵的6

7年的寿命中,1/3至1/2的患者将需要接受另外的手术来纠正问题。此外,每次手术都有明确的并发症发生率。
[0013]因此,迫切需要提供特定于特定神经元以治疗神经肌肉障碍和神经运动障碍(如痉挛)并且能够用于受本文档来自技高网
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法,所述方法包括:(i)提供神经元群体,其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”);(ii)使所述群体与第一多个测试AAV颗粒接触;(iii)分离已经感染所述神经元的第一多个AAV颗粒;以及(iv)确定已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。2.一种筛选能够感染受试者的神经元的特定亚区室的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法,所述方法包括:(i)提供神经元群体,其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”);(ii)使所述群体与第一多个测试AAV颗粒接触;(iii)分离已经感染所述神经元的特定亚区室的第一多个AAV颗粒;以及(iv)确定已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。3.一种筛选能够感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法,所述方法包括:(i)提供包含神经元的群体,其中所述神经元衍生自诱导多能干细胞(“iPSC”)或胚胎干细胞(“ESC”),并且其中所述神经元各自具有第一特定亚区室和第二特定亚区室;(ii)这样放置所述神经元,使得所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室在远端彼此分开;(iii)使所述第一特定亚区室与第一多个测试AAV颗粒接触;(iv)分离已经感染所述第二特定亚区室的第一多个AAV颗粒;以及(v)确定已经感染神经元的所述第二特定亚区室的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列。4.根据权利要求3所述的方法,其中:(a)在步骤(ii)中,将所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室分组在一个或多个容器的不同物理区域中;和/或(b)将所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室分组在微流室的一个或多个容器的不同物理区域中;和/或(c)所述第一特定亚区室和所述第二特定亚区室通过轴突连接;和/或(d)所述一个或多个容器进一步包含骨骼肌细胞和/或肌细胞和/或感觉神经元。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述神经元是运动神经元。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,所述方法进一步包括,在所述确定步骤后:(i)使用已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列产生第二多个测试AAV颗粒;(ii)用所述第二多个测试AAV衣壳重复步骤(i)至(iii),以便分离已经感染所述神经元的第二多个AAV颗粒;以及(iii)确定已经感染所述神经元的所述第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列,其中
与所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列相比,所述第二多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列在感染所述神经元方面更有效。7.根据权利要求6所述的方法,其中所述第二多个测试AAV颗粒通过以下中的一种或多种产生:(i)对已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行随机诱变;ii)对已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列进行改组;以及iii)在已经感染所述神经元的所述第一多个AAV颗粒的衣壳编码核苷酸序列的VP1、VP2或VP3的不同区域插入长度为至多25个氨基酸的靶向或随机肽序列。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述iPSC或ESC来源于i)所述受试者,任选地人类受试者;和/或ii)所述受试者的皮肤样品;和/或iii)所述受试者的成纤维细胞。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中步骤(i)包括从iPSC或ESC衍生神经元的步骤。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法是筛选能够经由肌内注射感染受试者的神经元的腺相关病毒(“AAV”)颗粒的衣壳编码核苷酸序列的方法。11.一种通过根据前述权利要求中任一项所述的筛选方法鉴定的腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸。12.一种腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸序列,其与SEQ ID NO:11具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。13.一种腺相关病毒(“AAV”)衣壳编码核苷酸序列,其与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。14.一种重组腺相关病毒(“AAV”)表达载体,其包含根据权利要求11

13中任一项所述的衣壳编码核苷酸序列。15.根据权利要求14所述的表达载体,其中所述表达载体进一步包含编码转基因产物的转基因,其中当向受试者施用所述表达载体时,所述转基因产物能够改变神经元的兴奋性,任选地其中当向受试者施用所述表达载体时,所述转基因产物能够降低神经元的超兴奋性。16.根据权利要求15所述的表达载体,其中所述转基因产物:(a)当向受试者施用所述表达载体时,能够抑制神经元兴奋性;(b)当向受试者施用所述表达载体时,能够阻断神经元的突触传递;(c)是仅由合成配体激活的受体(RASSL);或者(d)是仅由设计药物激活的设计受体(DREADD)。17.根据权利要求14

16中任一项所述的表达载体,其中所述转基因或所述转基因产物是:(a)KCC2转基因或转基因产物,任选地其中:(i)所述KCC2转基因与SEQ ID NO:3具有至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、
85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性;或者(ii)所述KCC2转基因产物与SEQ ID NO:4具有至少50%、55%、60...

【专利技术属性】
技术研发人员:罗伯特
申请(专利权)人:UCL商业有限公司
类型:发明
国别省市:

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