神经障碍的活性依赖性基因疗法制造技术

本发明专利技术提供了包含编码多肽的多核苷酸序列的表达载体或载体系统，其中所述基因可操作地连接到适于驱动所述基因产物在受试者的神经细胞中表达的神经元活性依赖性启动子。所述表达载体的特征相结合以有利地改善对受试者的与神经元过度兴奋相关的神经障碍的治疗。本发明专利技术还提供了在相关治疗方法中使用的表达载体或载体系统，以及使用所述表达载体或载体系统的病毒颗粒、细胞、试剂盒和方法。试剂盒和方法。试剂盒和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】神经障碍的活性依赖性基因疗法
[0001]本申请要求于2020年3月27日提交的GB2004498.8的优先权，其内容和要素出于所有目的通过引用并入本文。


[0002]本专利技术总体上涉及包括以活性依赖方式表达的基因产物的方法和材料，所述基因产物可以用于治疗神经障碍，如癫痫。

技术介绍

[0003]以神经元异常放电为特征的神经回路障碍给社会造成了巨大负担，并且药物治疗不充分。例如，癫痫影响高达1％的人群。在这些患者中，30％对药物治疗是难治的(“耐药”)，并且手术切除发生癫痫发作的脑区域(致癫痫区)仍然是实现无癫痫发作的最佳希望。然而，这种手术不适合许多人，因为有损害皮质的雄辩区域或涉及诸如记忆、语言、视觉或运动控制等功能的白质通路的风险(Kwan,P.等人(2011),N.Engl.J.Med.365,919
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926；Picot,M.C.等人(2008),Epilepsia 49,1230
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1238)。
[0004]新的抗癫痫药物对难治性癫痫几乎没有影响，并且癫痫发作未受控制的人继续经历共病、社会排斥和癫痫猝死(SUDEP)的重大风险。难治性癫痫主要是局灶性的(即，以致癫痫区引起的癫痫发作为特征)，但原发性全身性癫痫也可能对药物疗法具有抗性。
[0005]尽管手术切除致癫痫区可以实现无癫痫发作，但它不适合90％患有难治性癫痫的人。此外，手术切除的范围受到不可逆神经缺损风险的限制，这意味着许多接受手术的患者继续患有癫痫发作。使用激光的微创消融术在靶向脑中难以接近的深部结构方面具有作用，但是也受到损害邻近结构的风险的限制。深部脑刺激和其他神经调节治疗的有效性有限。
[0006]基因疗法作为手术治疗耐药性局灶性癫痫的合理替代方案是一种有前景的候选方案。例子包括神经肽Y和Y2受体的过表达(Woldbye等人,2010)、Kv1.1过表达(Wykes等人,2012；Snowball等人,2019；WO2018/229254)；使用只由设计药物激活的设计受体(DREADD)的化学遗传学，所述受体例如hM4Di(Katzel等人,2014)；以及使用增强型谷氨酸门控氯化物通道eGluCl(Lieb等人,2018)。
[0007]然而，目前的实验性基因疗法基于神经元兴奋性的永久性改变(神经递质、离子通道或受体过表达)或者光或化学物质的外源递送以实现神经元活性的按需调节(光遗传学和化学遗传学)。这些方法由于脱靶效应而具有局限性。它们不会区分参与癫痫发作的神经元与混合的“旁观者”神经元。通过类比，深部脑刺激(DBS)是靶向特定脑部位的疗法(例如，针对帕金森病、OCD和抑郁症)的一个例子，但是它不是细胞类型特异性的并且可产生副作用。此外，尽管可以按需使用光遗传学和化学遗传学，但决定何时通过光或药物递送来激活疗法需要另外的步骤，如人为干预或检测癫痫发作的计算机。一种避免这些限制中的一些限制的基因疗法是使用eGluCl，它响应于细胞外谷氨酸的积累(就像在癫痫中发生的那样)而打开，但是这种方法在常见形式的癫痫中的有效性是未知的，并且它依赖于非哺乳动物
膜蛋白的永久性表达，这可能表示有免疫原性的风险。
[0008]因此，迫切需要开发具有更少的脱靶效应或副作用的对于难治性癫痫以及其他神经障碍的替代疗法。

技术实现思路

[0009]诸位专利技术人已经发现，通过使用神经元活性依赖性启动子来驱动或改变影响神经元特性的基因的表达，可以实现对驱动癫痫发作或促成在脑中传播癫痫发作的神经元的选择性调节。以这种方式，可以在更少的脱靶效应或副作用的情况下治疗神经障碍，如难治性癫痫。
[0010]例如，在一种情况下，当将钾通道基因KCNA1置于活性依赖性c
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Fos启动子的控制下时，响应于强烈的神经元活性(例如，癫痫发作)而诱导KCNA1表达的上调，并且这会导致神经元兴奋性和神经递质释放降低，从而引起对癫痫发作开始或传播的易感性降低。如果回路活性恢复到接近正常水平，则启动子活性降低，并且钾通道的表达恢复到基线。因此，这种基因疗法对过度活跃的神经元(与旁观者神经元相反)和极度活跃持续的时间都是特异性的。
[0011]在另一种情况下，当将由dCas9(也称为核酸内切酶缺陷型cas9)和转录激活因子构成的融合蛋白置于活性依赖性c
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Fos启动子的控制下时，响应于强烈的神经元活性(例如，癫痫发作)而诱导该蛋白的上调，并且在存在适当的单一指导RNA(sgRNA)的情况下，这可导致内源基因的表达改变。然后内源基因(例如，KCNA1)的表达改变会导致神经元兴奋性和神经递质释放降低，从而引起对癫痫发作开始或传播的易感性降低。如果回路活性恢复到接近正常水平，则启动子活性降低，并且融合蛋白(和内源基因)的表达恢复到基线。因此，同样，这种基因疗法对过度活跃的神经元(与旁观者神经元相反)和极度活跃持续的时间都是特异性的。
[0012]已经显示c
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Fos启动子的活性响应于几种形式的强烈神经元激活而增加(例如，Hunt等人,1987PMID:3112583；Singewald等人,2003PMID:12586446)，并且还在星形胶质细胞(Morishita等人,PMID:21785243)、少突胶质细胞(Muir和Compston,1996PMID:8926624)和小胶质细胞(Eun等人,2004PMID:15522236)中报道了c
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Fos激活。因此，无法预测在癫痫治疗中使用活性依赖性启动子将产生更少的脱靶效应。此外，无法预测以这种方式使用的活性依赖性启动子将提供足够的表达以在体内具有功能效应或改进的功能效应。
[0013]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种用于在治疗受试者的与神经元过度兴奋相关的神经障碍的方法中使用的表达载体或载体系统，所述载体或载体系统如权利要求中所定义。在相关的情况下，术语“载体”在详细描述中可指“载体系统”。
[0014]在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的表达载体或表达载体系统。
[0015]在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的制备病毒颗粒的体外方法。在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的病毒颗粒，以及在如权利要求中所定义的方法中使用的此类病毒颗粒。
[0016]在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的试剂盒。
[0017]在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的治疗神经障碍的方法。
在另一个方面，本专利技术提供了一种确认基因产物的存在的方法，所述方法如权利要求中所定义。
[0018]在另一个方面，本专利技术提供了一种如权利要求中所定义的细胞。
[0019]现在将更详细地讨论本专利技术的一些特定方面。
[0020]活性依赖性启动子
[0021]术语“神经元活性依赖性启动子”(或如本文可互换使用的“活性依赖性启动子”)是指响应于神经细胞中的神经元活性的变化而改变或驱动靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在治疗受试者的与神经元过度兴奋相关的神经障碍的方法中使用的表达载体，所述载体包含：(a)(i)编码多肽(“基因产物”)的多核苷酸序列(“基因”)，所述多肽在所述受试者的神经细胞中表达时改善所述障碍，其中所述基因可操作地连接到(ii)适于驱动所述基因产物在所述受试者的神经细胞中表达的神经元活性依赖性启动子；或者(b)(i)编码中间多肽(“中间基因产物”)的中间多核苷酸序列(“中间基因”)，所述中间多肽改变另外的多核苷酸序列(“另外的基因”)的表达，所述另外的基因编码另外的多肽(“另外的基因产物”)，所述另外的多肽在所述受试者的神经细胞中表达时改善所述障碍，其中所述中间基因可操作地连接到：(ii)适于驱动所述中间基因产物在所述受试者的神经细胞中表达的神经元活性依赖性启动子。2.根据权利要求1所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因产物或中间基因产物或另外的基因产物的表达水平在所述神经元变得更加兴奋时增加并且在所述神经元变得不那么兴奋时降低。3.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是锥体神经元活性依赖性启动子。4.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是立即早期基因(IEG)启动子。5.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是c
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Fos。6.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子具有包含以下或由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:3中所示的核苷酸序列或者与SEQ IDNO:3中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。7.根据权利要求1
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4中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是Arc，或者其中所述启动子包含含有Arc核苷酸序列的一部分的核苷酸序列。8.根据权利要求1
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4中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是mArc(“最小Arc”)。9.根据权利要求7或权利要求8所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子具有包含以下或由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:15中所示的核苷酸序列或者与SEQ IDNO:15中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。10.根据权利要求1
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4中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是ESARE(“增强型突触活性响应元件”)。11.根据权利要求9所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子具有包含以下或由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:16中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。12.根据权利要求1
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4中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是NRAM(“Npas4特异性稳健活性标记”)。13.根据权利要求11所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子具有包含以下
或由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:17中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。14.根据权利要求1
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4中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子是Egr1。15.根据权利要求13所述的用于所述用途的表达载体，其中所述启动子具有包含以下或由以下组成的核苷酸序列：SEQ ID NO:18中所示的核苷酸序列或者与SEQ ID NO:18中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。16.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因或另外的基因是离子通道基因，并且所述基因产物或另外的基因产物是离子通道。17.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因或另外的基因是钾离子通道基因，并且所述基因产物或另外的基因产物是钾离子通道。18.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因或另外的基因是KCNA1基因，并且所述基因产物或另外的基因产物是Kv1.1钾通道。19.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因或另外的基因是工程化KCNA1基因，并且所述基因产物或另外的基因产物是编辑的Kv1.1钾通道。20.根据权利要求19所述的用于所述用途的表达载体，其中所述工程化KCNA1基因具有与SEQ ID NO:1中所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述编辑的Kv1.1钾通道具有与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，并且在对应于SEQ ID NO:2中所示的氨基酸残基400的位置处包含缬氨酸氨基酸残基。21.根据权利要求1
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16中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述基因或另外的基因是KNCJ2基因，并且所述基因产物或另外的基因产物是Kir2.1钾通道。22.根据权利要求21所述的用于所述用途的表达载体，其中所述KNCJ2基因具有与SEQ ID NO:13中所示的核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列，并且其中所述Kir2.1钾通道具有与SEQ ID NO:14中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。23.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述另外的基因是内源基因，并且所述另外的基因产物是内源基因产物。24.根据权利要求23所述的用于所述用途的表达载体，其中所述内源基因是KCNA1或KCNJ2。25.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述中间基因是核酸内切酶缺陷型cas(“dcas”)，如dcas9、spCas9或saCas9。26.根据权利要求25所述的用于所述用途的表达载体，所述表达载体进一步包含：(a)RNA聚合酶III，任选地其中所述聚合酶III是U6；以及(b)靶向所述另外的基因的sgRNA(“单一指导RNA”)。27.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体，其中所述中间基因产物经由中间表达系统、任选地中间诱导型表达系统增加所述另外的基因的表达。28.根据权利要求27所述的用于所述用途的表达载体，其中所述中间诱导型表达系统
是Tet
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On表达系统。29.一种在治疗受试者的与神经元过度兴奋相关的神经障碍的方法中使用的表达载体系统，所述表达载体系统包含：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含适于驱动反向四环素控制的反式激活因子(“rtTA”)在所述受试者的神经细胞中表达的神经元活性依赖性启动子；以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含适于驱动根据前述权利要求中任一项所述的中间基因或另外的基因的表达的Tet
‑
On启动子，其中所述第一核苷酸、第二核苷酸或表达系统任选地进一步包含：(c)RNA聚合酶，任选地其中所述RNA聚合酶是RNA聚合酶II或RNA聚合酶III，进一步任选地其中所述RNA聚合酶III是U6；以及(d)靶向所述另外的基因的sgRNA(“单一指导RNA”)，和/或(e)四环素，任选地多西环素。30.根据权利要求29所述的用于所述用途的表达载体系统，所述表达载体系统包含：(a)第一核苷酸序列，所述第一核苷酸序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:37或39中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:37或39中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列；以及(b)第二核苷酸序列，所述第二核苷酸序列包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:35或36中所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:35或36中所示的核苷酸序列具有至少80％同一性的核苷酸序列。31.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中所述载体或载体系统可以引起所述受试者的神经元的尖峰频率降低超过5％、或超过10％、或超过20％、或超过30％、或超过40％、或超过50％、或超过60％、或超过70％、或超过80％、或超过90％、或超过91％、或超过92％、或超过93％、或超过94％、或超过95％、或超过96％、或超过97％、或超过98％、或超过99％或100％。32.根据权利要求31所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中所述载体或载体系统可以引起所述受试者的神经元的尖峰频率降低超过75％。33.根据权利要求31或权利要求32所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中在21DIV(体外天数)时或之后使用多电极阵列来测量神经元的尖峰频率的所述降低。34.根据权利要求31
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33中任一项所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中相对于包含SEQ ID NO:6的载体测量神经元的尖峰频率的所述降低。35.根据权利要求31
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34中任一项所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中所述神经元是原代皮质神经元。36.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中所述载体或载体系统可以在神经元中引起每秒少于10个动作电位、或每秒少于5个动作电位、或每秒少于4个动作电位、或每秒少于3个动作电位、或每秒少于2个动作电位、或每秒没有动作电位。37.根据前述权利要求中任一项所述的用于所述用途的表达载体或载体系统，其中所述载体或载体系统可以导致神经元中的静息膜电位为小于
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【专利技术属性】
技术研发人员：G，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，
类型：发明
国别省市：