抗CK-MB单克隆抗体产生的杂交瘤制造技术

抗CK-MB单克隆抗体产生的杂交瘤的制备，属于免疫分析医学领域。本发明专利技术提供了一种特异性识别CK-MB的单克隆抗体，产生该单克隆抗体的杂交瘤，以及使用该单克隆抗体检测CK-MB的高灵敏度的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利说明】
本专利技术涉及CK-MB单克隆抗体产生的杂交瘤。【背景知识】肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)有四种同工酶型式:脑型(CK-BB)、肌肉型(CK-MM)、杂化型(CK-MB)和线粒体型(MiMi)，其中MB型主要存在于心肌细胞中。同工酶具有相同的分子重量和催化相同的反应，单分子结构和来源不同。CK-MM主要发现在骨骼肌中，CK-BB来源于脑组织和肠道，而CK-MB的主要来源是心肌。血清中CK-MB水平的定量化可以辅助诊断心肌损伤。由于急性心肌梗塞，上升的CK-MB水平与心肌细胞的死亡和损伤有关。心肌损伤在胸痛发作后3-8小时内出现，CK-MB的水平在12-24小时内达到高峰浓度，在24-48小时内通常恢复到基准水平，因此可以检测CK-MB水平。该上升和下降模式指示心肌细胞损伤，通过在合适的间隔时间分析CK-MB样品，可以检测出该典型模式。某些心肌梗塞相对微弱，产生非常少的CK-MB。因此重要点是采用灵敏度的检测，检测CK-MB水平的微弱上升。除心肌梗塞以外的情况，特别是冠状动脉旁路手术、瓣膜替换术或先天性缺损修补术等心脏手术，可能导致血清CK-MB水平上升。但在该情况下，CK-MB水平不会表现出以上心肌梗塞特有的上升和下降模式。有时监视病人的CK-MB水平是为了将心肌梗塞当作并发症检测。其他情况也可能导致CK-MB水平上升，当心肌梗塞的诊断不清楚时，应予考虑，这些情况包括骨骼肌损伤、皮肌炎、雷依氏综合症、用药过量或慢性酒精中毒等。【
技术实现思路
】本专利技术的目的在于提供一种抗CK-MB单克隆抗体以及建立一种简单且具高灵敏度的检测CK-MB含量的方法，该方法可应用于心肌梗死的检测。以解决现有的单克隆抗体检测CK-MB的灵敏度不够或价格昂贵，不适合临床大规模的应用的缺点。本专利技术获得了能够产生特异性识别CK-MB的单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4-2与杂交瘤细胞株7-1，此2株细胞株分别在2015年7月17日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:C201590与CCTCC NO:C201591。此外，经过鉴定，两株单克隆抗体分别识别CK-MB的两个不同表位，通过4-2与7-1的结合建立了双抗体夹心酶联免疫反应方法，其是一种高灵敏度及高通量的检测系统。因此，本专利技术提供了下面所述的I至3的内容:1.抗CK-MB的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC NO:C201590和CCTCC NO:C201591。2.抗CK-MB的单克隆抗体，分别由保藏号为CCTCC NO:C201590和CCTCC NO:C201591的杂交瘤细胞系所分泌，所述单克隆抗体命名为4-2和7_1。3.如权利要求2所述的抗CK-MB单克隆抗体的应用，即利用所述的单克隆抗体的双抗体夹心法ELISA检测CK-MB，夹心法两两配对的抗体来源于保藏号为CCTCC NO:C201590杂交瘤分泌的抗体4-2和保藏号为CCTCC NO:C201591杂交瘤分泌的抗体7_1，其步骤包括:(I)以所述的两两配对的单克隆抗体4-2包被；(2)加入待测样品孵育；(3)以所述的两两配对的HRP标记的另一株单克隆抗体7-1作为二抗，加入反应体系;(4)洗涤后加入酶反应底物，以450nm读取OD值；(5)结果表明检测的灵敏度很高。【【附图说明】】附图1显示的是本专利技术中的杂交瘤所产生的抗CK-MB单克隆抗体在ELISA方法中滴度测量结果。附图2显示的是标记HRP的抗CK-MB单克隆抗体滴度测量结果。附图3显示的是夹心法ELISA(S-ELISA)系统的检测灵敏度。【【具体实施方式】】下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外，应理解，在阐述了本专利技术的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动和修改，这些等价形式同样是本申请中权利要求书中所限定的范围。实施例1:动物免疫 选择与所用的骨髓瘤细胞同源的8周龄左右的雄性Balb/C健康小鼠，抗原是蛋白量为30ug的CK-MB抗原与弗氏完全佐剂、PBS混合，完全乳化后，30ug每只每次，采取背部多点，及腋下、腹股沟免疫。免疫程序:经15天后进行第二次相同剂量与弗氏不完全佐剂混合免疫；再15天后进行第三次相同剂量与福氏完全佐剂混合免疫；10天后尾部取血用间接ELISA方法测血清滴度，用相同剂量的纯抗原不加佐剂加强免疫；3天后取脾细胞进行融入口 ο实施例2:杂交瘤细胞的构建1、骨髓瘤细胞株的培养及制备(I)本专利技术采用的是SP2/0骨髓瘤细胞株，该细胞株生长及融合效率均佳，倍增时间为10-12小时。融合时选择处于对数生长期、细胞形态和活性佳的细胞。骨髓瘤细胞在融合前应先在培养基上作适应培养，使细胞生长到最佳的状态(即对数生长期)；(2)将培养的SP2/0吸至50mL的管中，离心，弃上清，悬起，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。2、脾细胞的制备(I)将小鼠放在密封袋中，充CO2待其窒息死亡；(2)将小鼠消毒固定在解剖板上，在超净工作台中取脾，放在12mL培养基的培养皿中，剥掉粘连组织，研磨脾脏，直至剩白色组织为止，吸管全部吸起，再缓慢打出使组织块粘连的管壁上，离心，弃上清，加1mL的红细胞裂解液裂解lOmin，再加20_25mL的培养基终止其反应，离心后，弃上清，加1mL的培养基，吸取少量10倍稀释计数。3、细胞融合加强免疫后3天做细胞融合。细胞融合是杂交瘤技术的中心环节，基本步骤是取处于对数生长期的Sp2/0细胞与脾细胞1: 10混和，通过聚乙二醇(PEG)法以获得杂交瘤细胞，命名为4-2和7-1。所获得的杂交瘤细胞悬浮在含有饲养细胞的HAT培养基中，然后加入到96孔板中，在37°C，5%CO2的培养箱中封闭培养12天。实施例3:单克隆抗体的制备及筛选1、单克隆抗体的制备从实施例2中所获得的杂交瘤细胞的孔格中回收培养基的上清液，选取在ELISA方法中与CK-MB抗原反应的单克隆抗体。2、单克隆抗体的筛选(I)将10uL浓度为0.5ug/mL的CK-MB抗原到96孔板的每个孔格中，于4°C过夜后使其固定于固相；(2)用150uL浓度为I %的牛血清白蛋白进行封闭2小时；(3)将10uL杂交瘤细胞的培养基上清液加入到每个孔格中，于37°C反应2小时，然后加入稀释10000倍的辣根过氧化物酶偶联的羊抗鼠抗体于37°C反应I小时；(4)使用四甲基联苯胺微孔过氧化物酶底物(TMB)作为底物进行显色20min ;(5)添加50uL浓度为0.lmol/L的硫酸终止反应后，测量450nm的吸光度；(6)选出吸光度大约为3的4-2和7-1，并通过有限稀释法进行亚克隆。3、单克隆抗体的大量制备及和纯化将亚克隆后的细胞用细胞培养转瓶进行扩大培养，约20天后，收集上清，用葡萄球菌A蛋白(Protein A)进行亲和层析纯化。得到的单克隆抗体分别命名为4_2和7_1。4、单克隆抗体效价的测定所筛选出的2种mAb的效价通过ELISA方法来测定。分别加入4_2、7_1 (1ug/mL)，在反应后，使用辣根过氧化物酶偶联的抗-小鼠抗体与TMB进行显色，两种mAb效价达到10 本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗CK‑MB的杂交瘤细胞株，其保藏号分别为CCTCC NO：C201590和CCTCC NO：C201591。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李喜梅，刘云成，赵洪梅，李春雷，窦巍巍，董小芳，
申请(专利权)人：大庆麦伯康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23