一种增殖细胞核抗原的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株制造技术

一种增殖细胞核抗原的单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCC No.12045。所述杂交瘤细胞系分泌的增殖细胞核抗原的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结合增殖细胞核抗原；优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。

Monoclonal antibody for proliferating cell nuclear antigen and hybridoma cell line secreting the monoclonal antibody

A monoclonal antibody, PCNA and secreting the monoclonal antibody hybridoma cell strains of hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies against the proliferating cell nuclear antigen, which is characterized in that the collection number of the hybridoma cell lines for CGMCC No.12045. The monoclonal antibody of the proliferating cell nuclear antigen secreted by the hybridoma cell line is characterized in that it is capable of specifically binding to proliferating cell nuclear antigen; preferably, the subtype of the monoclonal antibody is IgG2b.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种增殖细胞核抗原(PCNA)的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及所述的抗体的应用。
技术介绍
DNA的合成复制是细胞增殖分裂的重要基础(1)。细胞从G1期进入S期从而进行DNA的复制，将整个基因组复制成为完全相同的两份。然后细胞经过G2期再进入M期进行有丝分裂，从而一个细胞分裂为两个细胞，实现了细胞的增殖，将遗传信息传递给新的细胞。DNA的复制需要招募一系列的DNA合成相关的蛋白的参与，而增殖细胞核抗原(proliferatingcellnucleusantigen，PCNA)就是其中之一。PCNA单个蛋白大约36kd(2-3)，3个PCNA单体分子形成一个环状同源三聚体复合物。该环状复合物内直径3.4nm，而DNA的直径为2nm，并且环状结构内部为正电荷。因此，在DNA复制过程中，PCNA就能像套环一样将DNA套在其中，并可以沿着DNA滑动。同时PCNA作为一个招募其它功能蛋白的平台，将各种与DNA合成相关的蛋白募集过来，并随着PCNA在DNA上的滑动实现DNA的不断复制。由于PCNA与DNA的合成复制密切相关，因此它的表达量变化几乎是与DNA的合成水平的变化一致。而DNA的合成是细胞增殖的重要表现，因此PCNA的表达是反应细胞增殖状态的良好指标。众所周知，肿瘤细胞具有非常旺盛的增殖能力，因此PCNA的蛋白表达水平相比正常细胞都呈现明显的高表达。采用免疫组化方法检测肿瘤组织中的PCNA蛋白表达水平，可以评价肿瘤的细胞增殖状态。PCNA目前已经用于胃癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等的肿瘤临床诊断。有文献报道(5)，在结直肠癌患者中，PCNA表达高的肿瘤细胞生长能力强，细胞分化程度低，恶性程度高，易发生淋巴结转移，预后较差。同样，在卵巢癌组织中(6)，PCNA在低分化的肿瘤中表达明显高于高分化的肿瘤中的表达。PCNA高表达的肿瘤一般更易发生浸润和转移，其表达增高的程度与细胞的去分化有关。其结果表明PCNA是一个通用性很好的肿瘤诊断指标，主要用于辅助判断肿瘤的分化程度以及增殖活性，为肿瘤的治疗和预后的判断提供重要的参考依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种PCNA单克隆抗体(anti-PCNA)、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。本专利技术一个方面提供了一种分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCCNo.12045。本专利技术的另一个方面提供了一种由前述的杂交瘤细胞系分泌的增殖细胞核抗原的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结合增殖细胞核抗原；优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。本专利技术再一个方面提供了上述杂交瘤细胞系及上述的单克隆抗体在检测靶增殖细胞核抗原中的应用。本专利技术再一个方面提供了一种包含上述杂交瘤细胞系及上述的单克隆抗体的试剂盒。本专利技术再一个方面提供了前述的杂交瘤细胞系及前述的单克隆抗体在检测癌细胞的试剂盒中的应用，所述癌细胞优选为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞，更优选为直肠癌。专利技术再一个方面提供了前述杂交瘤细胞系的制备方法，1.抗原制备：(1)获得目的基因以TrizolReagent试剂提取HeLa细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA并以cDNA为模板通过PCR扩增PCNA基因；(2)构建重组表达载体将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体pET41a，构建重组质粒pET41a-PCNA；载体经过酶切和测序鉴定后用于转化表达细菌；(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达；(4)诱导表达和纯化将含有表达质粒的Rosetta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃度，220rpm培养10hr；将菌液按1:100稀释倍数接种于200m的LB培养基，培养至OD值为0.6，加入0.1mMIPTG诱导表达，在20℃度下作用5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯化重组抗原PCNA，以SDS-PAGE电泳分析；2.杂交瘤的制备：(1)免疫动物使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射：第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原)；第二次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；第三次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用western法检测效价，选择效价达到1:1000的小鼠用于融合；加强免疫融合前3天，向待取脾小鼠进行加强免疫，小鼠腹腔注射200ul液体(含60ug抗原，溶剂为1×PBS，pH7.4)；(2)、细胞融合采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，放入带200目不锈钢网的平皿中研磨，制备细胞悬液；将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按1:5-1:10比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇(50％)；采用HAT选择培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选；用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：将抗原用包被液(pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液)稀释为8ug/ml加入96孔酶标板中，50ul/孔，放入4℃冰柜中包被过夜。弃去包被液，用PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板三次，加入封闭液3％BSA-PBST(加入3％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液)，100ul/孔，37℃孵育1小时；弃去封闭液，PBST(磷酸盐缓冲液，pH7.4)洗板一次，甩干板子；将杂交瘤细胞培养上清加入酶标板100ul/well，同时加入PBST(磷酸盐缓冲液)作为阴性对照。37℃孵育1小时；弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加入稀释好的anti-mouseIgG/HRP，100ul/well，37℃孵育1小时；弃上清，用洗板机PBST洗板三次，加底物TMB100ul/well，室温，避光37℃，10-15min后加入50ul终止液(2mol/L硫酸)；使用酶标仪测定，酶标仪设置为：450nm比色；和阴性对照相比，OD值2.5倍之上的为阳性；筛选得到抗PCNA的杂交瘤细胞株，命名为2E1，亚型鉴定为IgG2b。以有限稀释法，对筛选出的阳性杂交瘤细胞株2E1进行单克隆筛选，获得能产生WB稀释比>1:1000的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆，获得阳性杂交瘤细胞为抗人PCNA杂交瘤细胞系2E1，其已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.12045，保藏日为2016年3月10日。专利技术再一个方面提供了前述的单克隆抗体的制备方法，将前述的杂交瘤细胞株2E1接种至BALB/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中获得抗体(本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCC No.12045。

【技术特征摘要】
1.一种分泌增殖细胞核抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述杂交瘤细胞系的保藏号为CGMCCNo.12045。2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌的增殖细胞核抗原的单克隆抗体，其特征在于，其能够特异的结合增殖细胞核抗原；优选地，所述单克隆抗体的亚型为IgG2b。3.权利要求1所述的杂交瘤细胞系及权利要求2所述的单克隆抗体在检测靶增殖细胞核抗原中的应用。4.一种包含权利要求1所述的杂交瘤细胞系和/或权利要求2所述的单克隆抗体的试剂盒。5.权利要求1所述的杂交瘤细胞系及权利要求2所述的单克隆抗体在检测癌细胞的试剂盒中的应用，所述癌细胞优选为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、宫颈癌细胞，更优选为直肠癌。6.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞系的制备方法，1.抗原制备：(1)获得目的基因以TrizolReagent试剂提取HeLa细胞总RNA，将总RNA反转录为cDNA并以cDNA为模板通过PCR扩增PCNA基因；(2)构建重组表达载体将步骤(1)获得的PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入表达载体pET41a，构建重组质粒pET41a-PCNA；载体经过酶切和测序鉴定后用于转化表达细菌；(3)获得含重组表达质粒的表达菌种将步骤(2)获得的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞，用含有硫酸卡那霉素的LB固体培养基筛选，挑取单克隆用于抗原表达；(4)诱导表达和纯化将含有表达质粒的Rosetta(DE3)细菌单克隆接种于10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃度，220rpm培养10hr；将菌液按1:100稀释倍数接种于200m的LB培养基，培养至OD值为0.6，加入0.1mMIPTG诱导表达，在20℃度下作用5hr，收集菌液超声破碎，从上清中纯化重组抗原PCNA，以SDS-PAGE电泳分析；2.杂交瘤的制备：(1)免疫动物使用6-8周龄雌性BALB/c小鼠，按照预先制定的免疫方法进行三次免疫注射：第一次免疫用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏完全佐剂，含100ug抗原)；第二次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹腔注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；第三次免疫间隔两周，用2ML注射器每只小鼠腹股沟皮下注射注射0.2ml乳化液(100ul纯化的重组蛋白PCNA(用1×PBS稀释)+100ul弗氏不完全佐剂，含100ug抗原)；测效价根据融合时间安排，第三次免疫7-10天后取血检测，用western法检测效价，选择...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂子梅，邱俊康，张秦川，蒋洪娇，
申请(专利权)人：成都汇瑞新元生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51