一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用制造技术

一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫检测技术领域。本发明专利技术杂交瘤细胞株GW，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12014。抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体，它由所述杂交瘤细胞株GW分泌产生。此细胞株GW分泌的单克隆抗体，对尼卡巴嗪残留标志物（DNC）具有较好的特异性（IC

【技术实现步骤摘要】
一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用
本专利技术涉及一株抗尼卡巴嗪残留标志物DNC单克隆抗体杂交瘤细胞株GW及其应用，属于食品安全免疫检测
涉及单克隆细胞株GW及其产生的抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体。
技术介绍
尼卡巴嗪为二硝基均二苯脲和羟基二甲基嘧啶组成的1:1复合物，其中二硝基均二苯脲（DNC）被视为尼卡巴嗪残留的标志物。作为一种广谱、高效、性能稳定的抗球虫饲料药物添加剂，它具有较强的抗原虫作用，同时对球虫病也有一定的防治作用。主要用以预防鸡盲肠球虫(柔嫩艾美耳球虫)和堆型、巨型、毒害、布氏艾美耳球虫(小肠球虫)。据试验，感染球虫后48h内用药，能有效地抑制球虫发育，若用药迟过72h，则效果明显降低。且尼卡巴嗪推荐剂量对机体对球虫免疫力很少或没有影响。在防治鸡球虫病的同时，它还能促进鸡的生长发育，节约饲料，提高养鸡的经济效益。然而，作为抗球虫药物，其在家禽肌肉及组织中会造成不同程度的残留，而大部分药物随粪便排出体外。这些粪便用以农业施肥，从而给生态环境带来不利影响，进而威胁到人民的生命健康。目前检测尼卡巴嗪的方法主要是气相色谱法(GC)、液相色谱法(HPLC)、液质联用法（LC-MS）、液相二级质谱（LC-MS/MS）等仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的尼卡巴嗪残留检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和检测灵敏度的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种对尼卡巴嗪残留标志物（DNC）具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法。本专利技术提供一种抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的单克隆抗体对DNC具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立DNC的免疫学检测方法。本专利技术提供一种对DNC具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体的制备方法。本专利技术的DNC单克隆抗体，是由保藏号为CGMCCNo.12014的小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株GW所分泌。本专利技术提供的GW细胞株的制备基本步骤为：（1）免疫完全抗原的合成：称取Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），将这三种药物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，调节pH到5.0左右。在室温活化4h之后，将活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸盐缓冲液中，室温反应过夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；（2）异源包被的制备：称取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL无水DMF溶解，然后逐滴加入72µL2.5%戊二醛溶液。在室温搅拌活化30min之后，将活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸盐缓冲液中，室温反应4h，即得到异源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；（3）小鼠的免疫：尼卡巴嗪完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用尼卡巴嗪完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株GW；（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。本专利技术的有益效果：（1）本专利技术获得的抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体细胞株，对DNC有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为5μg/L）；（2）一种新的半抗原合成的思路，在于通过衍生得到半抗原，在用异原包被进行检测，得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。生物材料保藏保藏：抗尼卡巴嗪残留标志物（DNC）单克隆抗体杂交瘤细胞株GW已于2016年1月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo.12014。该小鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株GW也属于本专利技术的保护范围。附图说明图1.单克隆细胞株GW分泌的单克隆抗体对DNC的抑制标准曲线。具体实施方式本专利技术下面的实施例仅作为本
技术实现思路
的进一步说明，不能作为本专利技术的限定内容或范围。下面通过实施例对本专利技术作进一步说明。本专利技术通过将尼卡巴嗪完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对DNC有较好特异性和灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株。实施例1：杂交瘤细胞株GW的制备1、完全抗原的合成（1）免疫完全抗原的合成：称取将Ｎ-琥珀酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酰-Ｌ-丙氨酸４-硝基苯胺（SAN,CAS:52299-14-6）4.86mg（0.01mmol），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）5.16mg（0.025mmol），N-羟基丁二酰亚胺（NHS）3.0mg（0.025mmol），将这三种药物溶于0.5mLN,N-二甲基甲酰胺（DMF），调节pH到5.0左右。在室温活化4h之后，将活化液逐滴加入到溶解6mgBSA的0.05M碳酸盐缓冲液中，室温反应过夜，即得到免疫完全抗原（SAN-EDC-BSA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；（2）异源包被的制备：称取谷氨酸-γ-ρ-硝基苯胺（L-γ-Glutamyl-p-nitroanilide，GAN，CAS:67953-08-6）3.63mg，用0.5mL无水DMF溶解，然后逐滴加入72µL2.5%戊二醛溶液。在室温搅拌活化30min之后，将活化液逐滴加入到溶解6mgOVA的0.05M碳酸盐缓冲液中，室温反应4h，即得到异源包被（GAN-戊二醛-OVA）混合液，通过透析分离偶联产物和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；2、动物免疫选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取尼卡巴嗪完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株抗尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株GW，保藏编号为CGMCC No.12014 。

【技术特征摘要】
1.一株抗尼卡巴嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株GW，保藏编号为CGMCCNo.12014。2.抗尼卡巴嗪单克隆抗体，其特征在于：它由权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：匡华，丁西，胥传来，徐丽广，马伟，吴晓玲，刘丽强，宋珊珊，郑乾坤，
申请(专利权)人：江南大学，得利斯集团有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32