一种改进的抗VEGFR‑2单克隆抗体制造技术

本发明专利技术涉及生物医药技术领域，具体涉及本发明专利技术涉及改进的抗VEGFR‑2单克隆抗体与应用。本发明专利技术在原有研究的基础上，以其中亲和力最高的两个为模板，进行计算机辅助模拟设计，设计了新的噬菌体抗体库，并进行了多轮筛选，得到了改进的重链可变区和轻链可变区氨基酸序列，该抗VEGFR‑2单克隆抗体的亲和力和生物学活性均高于原抗。本发明专利技术所得到的抗VEGFR‑2单克隆抗体具有较高的亲和力，在体外能够很好的抑制VEGFR‑2和其配体VEGF的结合，具有良好的生物学活性；可用于治疗肿瘤和黄斑变性等新生血管引起的疾病。

An improved anti VEGFR 2 monoclonal antibody

The present invention relates to the technical field of biological medicine, and particularly relates to the present invention relates to an improved anti VEGFR 2 monoclonal antibody and application of. The invention is based on the original research, in which the highest affinity two as a template to simulate the design of computer aided design, the new phage antibody library, and conducted several rounds of screening, the improvement of the variable region of heavy chain and light chain variable region amino acid sequence, the anti VEGFR 2 monoclonal antibody the affinity and biological activity were higher than that of the original anti. The anti VEGFR 2 monoclonal antibody with high affinity, can well inhibit the VEGFR 2 and its ligand binding of VEGF in vitro, has good biological activity; can be used for the treatment of macular degeneration and tumor neovascularization caused by disease.

【技术实现步骤摘要】
一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体
本专利技术涉及生物制药
，具体涉及本专利技术涉及一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体。
技术介绍
肿瘤生长依赖新生血管的形成已经在肿瘤生物学上研究的比较透彻。血管生成可提供氧气、营养物质、生长因子、荷尔蒙及蛋白水解酶,从而促进肿瘤细胞向远处扩散和转移，加速肿瘤的生长和恶化。血管生成是一个高度复杂的动态过程,由许多促/抗血管生成分子调节。血管生成的开关被认为是促血管生成超过抗血管生成的一个恶性标志。VEGF/VEGFR轴触发多重信号网络,导致上皮细胞存活、有丝分裂、转移和分化、血管渗透，VEGF及其受体在正常和病理血管生成中发挥着中枢作用。在人类许多种癌症中,增加的肿瘤血管化作用和肿瘤促血管生成因子的表达被证实与肿瘤的分级和恶性与否有关。血管内皮细胞生长因子(VEGF)又称血管通透因子,它是内皮细胞的特异性有丝分裂源,也是一种有效的血管形成和通透性诱导因子，已被鉴定的相应受体为VEGFR-1(Flt-1，FMS样酪氨酸激酶1)，VEGFR-2(又称为KDR/Flk-1,激酶插入嵌合受体、胎肝激酶-1)，VEGFR-3(Flt4)，神经纤维蛋白-1(neuropilin-1)，神经纤维蛋白-2。VEGFR-2是血管内皮细胞上的主要VEGF受体，是一种糖蛋白，其胞外区含有七个免疫球蛋白样区(含配体结合域和受体二聚化结构域)，胞内插入了酪氨酸激酶催化结构域，主要在内皮细胞上表达，其他如巨核细胞、视网膜远祖细胞、间充质干细胞，肿瘤细胞如黑色素瘤细胞、脑瘤和某些白血病细胞等。VEGF和VEGFR-2受体作为关键的血管内皮细胞特异因子信号传导途径的分子参与肿瘤新生血管的生成，VEGF的主要生物学功能都是通过VEGFR-2实现，VEGFR-2和VEGF结合后发生二聚体化，并且VEGFR-2胞内的酪氨酸残基自身磷酸化，从而激活并将细胞膜/细胞质激酶级联反应信号传递到细胞核，可引发内皮细胞的一系列变化，包括血管内皮细胞增殖、存活、细胞骨架重排、细胞迁移以及基因表达等，并最终引起血管增生。由于VEGF/VEGFR2信号通路在肿瘤的发生发展中的关键作用，因此有不少针对VEGF/VEGFR2的信号通路的药物，如抗VEGF抗体贝伐单抗和抗VEGFR-2的抗体雷莫芦单抗。抗体是生物医药中技术含量最高、难度最大的一类药物，从2012年起，全球销售排名前十名的单药中有六个是抗体类药物，因此，抗体类药物市场的发展潜力巨大。抗体药物筛选最普遍应用的技术是噬菌体抗体库技术，噬菌体抗体库技术是继噬菌体展示技术发展而来的一项基因抗体工程的新技术，它可将含不同物种的全部抗体可变区基因的基因库转化成展示在噬菌体表面的蛋白库，不仅使单克隆抗体的生产更方便、快速、高效地在体外进行,还开辟了单克隆抗体人源化的新途径,促进了人类单克隆抗体生产的发展。我公司专利号为CN103333247B的专利就是通过计算机辅助设计和噬菌体抗体库技术筛选得到的一系列抗VEGFR-2的抗体，为获得抗VEGFR-2的抗体药物奠定了基础，我公司在进一步地研究中发现，上述专利中涉及的抗体在亲和力和生物学活性等方面还存在进一步的提升可能，基于此，我们在原有的研究基础上，对上述抗体进行了改进性优化。
技术实现思路
本专利技术提供了一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体；本专利技术以CN103333247B专利中亲和力最高的两个为模板，进行计算机辅助模拟设计，设计了新的噬菌体抗体库，并进行了多轮筛选，得到了一株亲和力和生物学活性均高于原专利抗体的新的抗VEGFR-2单克隆抗体。为实现上述目的，本专利技术提供了一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.1、SEQNO.2或SEQNO.3中的任一种；所述重链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.4。其中，本专利技术还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的抗体、多肽或蛋白。其中，本专利技术还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列或组合。其中，本专利技术还提供了一种包含上述多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述重组DNA表达载体的DNA序列中包含编码抗VEGFR-2抗体的上述重链可变区、重链恒定区、轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。其中，本专利技术还提供了一种转染上述重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌或酵母；优选哺乳动物细胞；进一步优选HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。其中，本专利技术的重链恒定区选自人的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b。其中，本专利技术还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的全长抗体和抗T1h单克隆抗体的片段，所述片段包含但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。其中，本专利技术还提供了一种包含上述轻链可变区或上述重链可变区的氨基酸序列的单链抗体、单域抗体、双特异抗体、抗体药物偶联物和嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。其中，本专利技术还提供了一种含有上述轻链可变区或上述重链可变区的单克隆抗体、人工载体、药物或药物组合物。其中，本专利技术还提供了一种含有上述轻链可变区或上述重链可变区的检测试剂或试剂盒。其中，所述抗体可用于治疗新生血管引起的疾病，所述疾病包括但不限于肿瘤和黄斑变性。其中，所述ScFv为单链抗体(single-chainfragmentvariable)；所述HEK293E细胞为人胚肾293E细胞(humanembryonickidney293Ecell)；CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞(chinesehamsterovarycell)；NS0细胞为小鼠NS0胸腺瘤细胞。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：本专利技术提供的抗VEGFR-2单克隆抗体具有较高的亲和力，在体外能够很好的抑制VEGFR-2和其配体VEGF的结合，在体外具有良好的生物学活性；开发前景广阔。本专利技术提供的抗VEGFR-2单克隆抗体用于治疗由肿瘤新生血管生成引起的疾病，包括但不限于下列疾病：非小细胞肺癌、转移性非小细胞肺癌、神经胶质瘤、结直肠癌、肝细胞癌、转移性肝细胞癌、HER2阴性的转移性乳腺癌、转移性胃腺癌、转移性结直肠癌、转移性黑色素瘤、转移性肾细胞癌等癌症以及黄斑变性等疾病。说明书附图图1、pScFvDisb-S质粒图谱；图2、梯度ELISA比较抗VEGFR-2单链抗体的相对亲和力；图3、蛋白质表达pTSE质粒图谱；图4、抗VEGFR-2单克隆抗体与KDR结合能力比较；图5、本专利技术抗体与细胞表面的VEGFR-2结合情况；图6、本专利技术抗体对人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖抑制作用。具体实施方式本专利技术详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本专利技术，而不是以任何方式限制本专利技术。本专利技术提供了一种改进的抗VEGFR-2单克隆抗体，包括：轻链和重链；所述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.1、SEQNO.2或SEQNO.3中的任一种；所述重链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.4；SEQNO.1(VEGFR-2轻链可变区序列1)：DIQMTQSPSSVSASIGDRVTITCRA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗VEGFR‑2单克隆抗体，其特征在于，包括：轻链和重链；所述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQ NO.1、SEQ NO.2或SEQ NO.3中的任一种；所述重链可变区的氨基酸序列包含SEQ NO.4。

【技术特征摘要】
1.一种抗VEGFR-2单克隆抗体，其特征在于，包括：轻链和重链；所述轻链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.1、SEQNO.2或SEQNO.3中的任一种；所述重链可变区的氨基酸序列包含SEQNO.4。2.一种包含上述权利要求1所述的轻链可变区或重链可变区的抗体、多肽或蛋白。3.一种包含权利要求1所述的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列或组合。4.一种包含如权利要求3所述的多核苷酸序列或组合的重组DNA表达载体；所述重组DNA表达载体的DNA序列中包含编码抗VEGFR-2抗体的所述重链可变区、重链恒定区、所述轻链可变区和轻链恒定区的氨基酸序列。5.一种转染如权利要求4所述的重组DNA表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含哺乳动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌或酵母；优选哺乳动物细胞；进一步优选HEK293E细胞、CHO细胞或NS0细胞。6.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海平，谷香果，白义，
申请(专利权)人：北京东方百泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11