单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有中和人白细胞分化抗原CD24生物活性的单克隆抗体以及该单克隆抗体的可变区序列。本发明专利技术以抗原肽与血蓝蛋白偶联物CD24-KLH作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。本发明专利技术同时克隆了抗CD24抗体可变区氨基酸序列。本发明专利技术的抗CD24抗体可与CD24特异性结合，因此可以用于治疗与CD24表达过量、异常、失控相关的疾病。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术是申请号2014100277955，申请日为2014-01-22，专利技术名称为抗CD24单克隆抗体、其可变区序列及其应用的分案申请。
本专利技术属于生物
，具体涉及一种能特异性结合人白细胞分化抗原CD24的单克隆抗体、其可变区序列及其应用。
技术介绍
人白细胞分化抗原CD24(clusterofdifferentiation24)是一种新近发现并重点研究的肿瘤标志物。当前研究表明，CD24分子是表观分子量介于30～70kDa之间的高度糖基化唾液酸糖蛋白。CD24包含33个氨基酸残基组成的核心蛋白骨架结构，具有16个潜在的O-或N-糖基化位点，与小鼠热稳定抗原高度同源；其成熟多肽能够通过羧基端的磷脂酰肌醇(glycosyl-phosphatidyl-inositol，GPI)锚定在细胞膜的表面。在生理情况下，CD24分子仅在未成熟B细胞、成熟粒细胞以及少数上皮细胞和神经细胞上低水平表达；而当机体处于病理状态时，多数恶性肿瘤细胞的表面均能检测到显著高水平表达的CD24分子，其表达水平的高低与肿瘤的发生和发展密切相关。P选择素表达于活化的血小板与内皮细胞表面，CD24是其配体之一。CD24分子高表达增强了肿瘤细胞对血小板及内皮细胞的粘附作用，促进了肿瘤的复发与转移。当然，作为细胞膜表面信号转导分子，CD24能够通过多种作用机制介导肿瘤细胞的的增殖、粘附、转移和侵袭。研究进一步发现，CD24表达与肝癌细胞的干性紧密相关，CD24可能成为一种新的肝癌干细胞表面标志物。由此可见，CD24有望成为研究肿瘤发生机制及开发相关诊断试剂的新靶标。
技术实现思路
本专利技术目的一在于提供一种抗CD24单克隆抗体制备方法。本专利技术目的二在于提供了一种抗CD24单克隆抗体。本专利技术目的三在于提供抗CD24单克隆抗体的可变区氨基酸序列。本专利技术以CD24核心区多肽与血蓝蛋白KLH偶联物(CD24-KLH)作为免疫原，免疫注射BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾脏细胞并将其与骨髓瘤细胞融合，获得了可表达抗CD24抗体的杂交瘤细胞株，此细胞株可用于制备抗CD24单克隆抗体。本专利技术克隆的抗体重链、轻链可变区氨基酸序列及其高变区如有SEQIDNo.1～16所示。本专利技术的单克隆抗体可与CD24特异性结合。附图说明图1为SDS-PAGE检测ProteinG亲和层析柱纯化产物结果。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1为腹水样品；泳道2为上样收集液；泳道3为20mM磷酸钠缓冲液洗柱收集液；泳道4～6为100mM甘氨酸缓冲液(pH3.5)洗脱收集液(每分钟收集1ml，共收集3ml)，泳道7～10为100mM甘氨酸缓冲液(pH2.7)洗脱收集液(每分钟收集1ml，共收集4ml)。图2为WesternBlot鉴定纯化后抗体与CD24之间相互作用。泳道M为标准分子量蛋白；泳道1市售CD24-Fc(购自北京义翘神州)；泳道2为市售Fc(购自北京义翘神州)。图3为PCR扩增抗体重轻链可变区基因琼脂糖电泳结果。泳道M为标准分子量DNA；泳道1为PCR扩增抗体重链可变区基因产物；泳道2为PCR扩增抗体轻链可变区基因产物。图4为竞争性ELISA测定单克隆抗体G7、A7、E4、G5、B4亲和力。具体实施方式实施例1抗CD24单克隆抗体杂交瘤细胞的制备1.免疫原CD24核心区由33个氨基酸残基组成，其分子量约为3.2kD，免疫原性较弱。本专利技术将抗原肽CD24与血蓝蛋白KLH偶联,以偶联物CD24-KLH作为免疫原，增强了CD24核心区多肽的免疫原性。本专利技术所用CD24-KLH由生工生物(上海)有限公司合成，纯度>90％。2.免疫动物本专利技术所用免疫动物为BALB/c小鼠，为SPF级别，由扬州大学比较医学院提供。免疫佐剂为QuickAntibody，购自北京康碧泉公司。免疫流程参照QuickAntibody说明书进行，具体如表1所示。表1.免疫途径与周期3.细胞融合1)细胞准备A.饲养层细胞于融合前一天取ICR小鼠(SPF级，购自扬州大学比较医学院)腹腔巨噬细胞，重悬于HAT培养液(购自GIBCO公司，含有黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶脱氧核苷)。接种于96孔板，置37℃，5％CO2培养箱中培养24h。B.骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞株SP20-Ag14(本实验室保存)不合成和分泌任何一种小鼠免疫球蛋白重链和轻链，此细胞对8-氮杂鸟嘌呤具有抗性，而在HAT选择性培养基不能生长。融合前一个星期，用普通的DMEM完全培养基(含15％FBS，购自GIBCO公司)分瓶培养杂交瘤细胞，以使细胞能生长良好。每一个融合准备250ml生长密度为2×l06cells/m1处于对数生长中期的健康细胞。C.免疫小鼠脾脏细胞处死免疫的小鼠，用酒精浸润后取出脾脏。预先准备好10cm2无菌培养皿，放入细胞筛网，并加入10ml无血清DMEM培养基。把脾脏置于细胞筛网上，并用无菌手术剪将脾脏剪成碎片。注射器内芯挤压研磨脾脏后，用5mlDMEM不完全培养基冲洗，使细胞通过过筛网进入50ml离心管中。收集脾脏细胞悬液，用于融合。2)融合A.准备20ml无血清的DMEM培养基和1mlPEG1450(购自Sigma公司)放于37℃保温。B.收集骨髓瘤细胞及脾脏细胞，常温下1500rpm离心5min，用无血清培养基洗两次，然后将其悬浮于10ml无血清培养基中。将5×108脾细胞和1×108骨髓瘤细胞充分混合，1500rpm离心5min，弃上清。轻轻敲击管子底部使细胞松散。C.取出在37℃预热的培养基和PEG，把细胞置于37℃水浴中，1min内匀速缓慢逐滴加1mlPEG，加完后及时用无血清的培养基终止。离心弃上清并用50mlHAT培养液重悬细胞，轻轻混匀。D.将细胞加入5块已铺有滋养细胞的96孔板中，每孔100μl。置37℃，5％CO2培养箱中培养4天。根据细胞生长状态，在筛选前用HAT培养液半换液1～3次，避免孔内培养基变黄。E.融合后7天后，改用含有HT培养液全换液。24h后，吸取细胞培养上清，间接ELISA检测筛选阳性克隆。3)杂交瘤的单克隆化挑选阳性值较高的克隆孔，采用有限稀释法将孔中的细胞分别稀释至每毫升含5、10和50个细胞，然后接种于96孔板中，每孔接种100μl。37℃、5％CO2湿润培养7～10天，出现肉眼可见的克隆即可检测细胞培养上清。在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。取抗体检测阳性孔的细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，其重链、轻链可变区中分别包含SEQ ID No.10~12和SEQ ID No.14~16所示CDR1~3区氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种抗CD24单克隆抗体的可变区序列，其特征在于，其重链、轻链可变区中分别包含SEQIDNo.10~12和SEQIDNo.14~16所示CDR1~3区氨基酸序列。
2.一种含有如权利要求1所述的可变区序列的抗CD24的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的结构中包括具有SEQIDNo.9和13所示重链和轻链的氨基酸序列。
3.一种基因工程抗体，其特征在于，它所含的重链和轻链可变区序列与权利要求1所述的可变区序列是一致的；该基因工程抗体包括但不限于：人-鼠嵌合抗体；或者是人源化抗体；或者是抗体的功能性片段Fab；或者是单链抗体；或者是重链可变区和完整轻链融合的抗体功能性片段VH-L；或者是重链和轻链的一个或多个CDR的排列、串联或组合而成的抗体功能性片段；或者是上述抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，王旻，罗晨，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32