汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用技术

一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体制备方法，包括设计扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框特异性引物，扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒，克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性得到重组蛋白；重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；单克隆抗体制备、亚型鉴定及效价检测。同时提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体应用。

Cloning and expression of Hantaan virus S gene, preparation method of monoclonal antibody and application thereof

Cloning, a Hantaan virus S gene expression and monoclonal antibody preparation method, including the design of amplification of S gene of hantavirus in the complete open reading frame of specific primers. The amplified S gene of hantavirus; cloned amplified S gene of hantavirus to pGM T vector, and transformed into Ecoli.TOP10 by state cells, TA positive clone plasmid. PGEX 6p 2 was cloned into the prokaryotic expression vector, recombinant plasmid pGEX - 6P - 2/S; the recombinant plasmid pGEX - 6P - 2/S in Ecoli.BL21 was transformed and expressed by IPTG induction, the recombinant protein was obtained inclusion bodies; the inclusion bodies were dissolved and renaturation of recombinant protein; immune Balb/c mice; mice with spleen cells myeloma cell fusion, selective culture; positive clone screening; monoclonal antibody preparation, subtype identification and titer detection. A monoclonal antibody against Hantaan virus S gene is also provided.

【技术实现步骤摘要】
汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，及单克隆抗体的应用。
技术介绍
汉坦病毒(Hantavirus，HV)属布尼亚病毒科，是一种分节段的单股负链RNA病毒，其会引起汉坦病毒肺综合征(HPS)和汉坦病毒肾综合征出血热(HFRS)等疾病，人和啮齿类动物(特别是鼠)均可被感染，其L、M、S基因分别编码依赖RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白(G1、G2)、及核衣壳蛋白(NP)。NP又称核蛋白，是病毒的主要结构蛋白，免疫原性强，刺激机体产生的抗体滴度高、维持时间长，在抗病毒免疫中起重要作用，不同株、型的病毒NP氨基酸序列保守，均携带有T细胞和B细胞抗原决定簇，能诱导机体产生特异性体液免疫应答和细胞免疫应答，可直接与体外转录病毒的RNA及被感染细胞的细胞器结合，起着调节病毒复制的作用，常用作为HV感染后的诊断蛋白。目前，汉坦病毒感染后的血清学诊断通常采用病毒感染的组织细胞等天然抗原，由于其敏感性、特异性和可操作性不是十分理想，故考虑是否可通过基因克隆与表达来获取具有良好的免疫原性和免疫反应性的重组NP，以替代天然抗原用于HV感染的实验室诊断。同时，在汉坦病毒感染后鼠组织器官标本中抗原检测方面，目前尚没有高特异性和高敏感性的单克隆抗体实际应用于实验室检测，绝大部分均是采用的多克隆抗体，检测结果存在一定的假阳性或假阴性，影响检测结果的准确性。
技术实现思路
鉴于上述状况，有必要提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，以获得具有良好的免疫原性和免疫反应性的汉坦病毒核蛋白，同时制备一种高特异性和高敏感性的抗汉坦病毒核蛋白的单克隆抗体而便于检测应用。本专利技术提供一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，所述方法包括：设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物，通过RT－PCR扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒；TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，在经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白；GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。进一步地，所述特异性引物包括上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’和下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’。进一步地，所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，再转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒步骤包括：扩增的汉坦病毒S基因与pGM－T载体以1：3的比例于22℃下进行连接反应，取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，抽提质粒，应用试剂盒进行PCR鉴定，应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双酶切鉴定，以确定得到TA克隆阳性质粒。进一步地，所述TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S步骤包括：TA克隆阳性质粒与pGEX－6P－2空质粒在37℃条件下进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切、电泳、目的片段回收纯化，二者在1：5比例下应用T4DNA连接酶于22℃连接反应20min，取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑选单克隆菌落，抽提质粒，取1μl进行PCR鉴定，应用EcoRⅠ、XholⅠ对重组质粒pGEX－6P－2/S进行双酶切，PCR产物及酶切产物于1.0％琼脂糖凝胶电泳，对重组质粒pGEX－6P－2/S进行序列测定。进一步地，所述包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白步骤，还包括GST－NP重组蛋白纯化、Westernblot鉴定、浓度测定步骤。进一步地，所述GST－NP重组蛋白，免疫Balb/c小鼠步骤，包括：以重组蛋白GST－NP为免疫原免疫小鼠，初次免疫采用1mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积完全佐剂注射器混匀，皮内多点注射；21天后采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀，皮内多点注射，第二次免疫；之后每隔14天采用0.5mg/ml浓度的重组蛋白GST－NP0.1ml与等体积不完全佐剂注射器混匀，腹腔直接注射，第三次、第四次免疫；小鼠第四次免疫后第7天眼眶处采血待用，即免疫小鼠血，并分离血清。进一步地，所述小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养的步骤，包括：包括：小鼠脾细胞的制备、脾细胞与骨髓瘤细胞融合以及选择性培养杂交瘤细胞，重组蛋白GST－NP融合检测。本专利技术还提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用，所述应用为异硫氰酸荧光素标记所制备的单克隆抗体，对汉坦病毒感染阳性标本检测。进一步地，所述汉坦病毒感染阳性标本采用汉坦病毒感染的鼠肺组织。进一步地，所述应用为用PBS调整单克隆细胞株的单抗浓度为10mg/ml，取1mgFITC溶于0.2mlDMSO，滴加于单克隆细胞株的单抗液内，室温避光作用2h进行交联反应，交联混合物经葡聚糖凝胶SephadexG25柱进行纯化，纯化后的单克隆抗体用含1％FBS的PBS进行1：100稀释，常规IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织进行检测，与1：50稀释的汉坦病毒多克隆抗体检测效果进行比较。本专利技术还提供一种汉坦病毒S基因单克隆抗体的应用，所述应用为用异硫氰酸荧光素标记所制备的单克隆抗体，对汉坦病毒感染的阳性动物脏器标本进行检测。进一步地，所述汉坦病毒感染阳性标本采用汉坦病毒感染的鼠肺组织。进一步地，所述应用为用PBS调整单克隆细胞株单抗浓度为10mg/ml，取1mgFITC溶于0.2mlDMSO，滴加于单抗液内，室温避光作用2h进行交联反应，交联混合物经葡聚糖凝胶SephadexG25柱进行纯化，纯化后的单克隆抗体用含1％FBS的PBS进行1：100稀释，常规IFA法对汉坦病毒感染的鼠肺组织进行检测，与1：50稀释的汉坦病毒多克隆抗体检测效果进行比较。本专利技术实施例的技术方案带来的有益效果是：上述汉坦病毒S基因克隆与表达方法，分离到了纯度较高的目的蛋白，最大程度地恢复了变性后重组蛋白的生物活性，重组蛋白GST－NP具有较好的免疫原性和免疫反应性，获得杂交瘤细胞株能稳定分泌高效价的单克隆抗体，经与FITC进行交联，建立的IFA试验能用于汉坦病毒感染后鼠组织器官标本中病毒抗原的检测。附图说明图1是本专利技术实施例的S基因原核重组质粒pGEX－6P－2/S构建结果的琼脂糖凝胶电泳图。其中：M.1kbDNAladder；1.PCR阴性对照；2.RT－PCR；3.重组质粒pGEX－6P－2/S为模板的PCR产物；4.空质粒pGEX－6P－2；5.重组质粒pGEX－6P－2/S；6.重组质粒pGEX－6P－2/S经EcoRI、XhoI双酶切；7.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括：设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物，通过RT－PCR扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒；TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白；GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。

【技术特征摘要】
1.一种汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述方法包括：设计一对扩增汉坦病毒S基因完整开放阅读框的特异性引物，通过RT－PCR扩增汉坦病毒S基因；将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒；TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S；将重组质粒pGEX－6P－2/S转化Ecoli.BL21菌体中，经IPTG诱导表达，得到包涵体；包涵体经溶解与复性，得到GST－NP重组蛋白；GST－NP重组蛋白免疫Balb/c小鼠；小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，选择性培养；阳性克隆筛选；以及单克隆抗体制备、亚型鉴定以及效价检测。2.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述特异性引物包括上游引物pGEX－6P－2－F：5’－TAGAATTCTGATGGCAACTATGGAGG－3’和下游引物pGEX－6P－2－R：5’－CGCTCGAGTTATAGTTTTAAAGGCTC－3’。3.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述将扩增的汉坦病毒S基因克隆到pGM－T载体，再转化Ecoli.TOP10感受态细胞，得到TA克隆阳性质粒步骤包括：扩增的汉坦病毒S基因与pGM－T载体以1：3的比例于22℃下进行连接反应，取一定量连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆，抽提质粒，应用试剂盒进行PCR鉴定，应用EcoRⅠ、XhoⅠ于37℃进行双酶切鉴定，以确定得到TA克隆阳性质粒。4.如权利要求1所述的汉坦病毒S基因克隆、表达、单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述TA克隆阳性质粒克隆到pGEX－6p－2原核表达载体，得到重组质粒pGEX－6P－2/S步骤包括：TA克隆阳性质粒与pGEX－6P－2空质粒在37℃条件下进行EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切、电泳、目的片段回收纯化，二者在1：5比例下应用T4DNA连接酶于22℃连接反应20min，取一定量的连接产物转化Ecoli.TOP10感受态细胞，涂布100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃倒置培养过夜，挑选单克隆菌落，抽提质粒，取1μl进行PC...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡亮，
申请(专利权)人：蔡亮，
类型：发明
国别省市：湖南,43