本发明专利技术属于生物医药技术领域，涉及携带tPA信号肽及密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。所涉及的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn核酸疫苗由密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒糖蛋白Gn基因序列和真核表达载体pJW4303组成，其5’端连接tPA信号肽序列。相对于野生型状态下的核酸疫苗，该核酸疫苗在体外表达中可更高效地表达目的蛋白且可将目的蛋白有效地分泌到胞外，在免疫哺乳动物后可有效地刺激免疫系统产生较好的体液免疫应答。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，涉及携带tPA信号肽及密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒氨基端糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗。
技术介绍
严重发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)是我国学者在2010年首次发现并鉴定的一种新型病毒。发热伴血小板减少综合征(SFTS)是由SFTSV感染引起的一种以发热、血小板减少、白细胞减少为主要特征的新发传染病，病情严重者可出现神经系统损伤、噬血细胞现象、多器官功能衰竭等，病死率可达12％-16.3％，甚至有报道为30％。SFTSV属于布尼亚病毒科白蛉病毒属。基因组序列分析显示，其基因组为单股负链RNA，由大片段L、中片段M和小片段S三个片段构成，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)，氨基端糖蛋白(Gn)和羧基端糖蛋白(Gc)，核蛋白(NP)和非结构蛋白(NSs)。作为一种新发现的病毒，其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物学特性、在疾病发生发展过程中的作用、以及免疫学特点还知之甚少；同时，从流行病学及临床诊疗过程的需求来看，亟需开发SFTS相关的预防用疫苗、诊断用抗体及治疗性抗体。核酸疫苗，又称DNA疫苗，其作用机制主要有以下三种：DNA编码的抗原通过体细胞经MHC Ⅰ类途径递呈给CD8+T细胞；DNA免疫直接转染专职的抗原递呈细胞(如树突状细胞)经MHC Ⅰ/Ⅱ类途径将抗原递呈给CTL、CD4+T细胞，并激活B细胞应答；被转染的体细胞被抗原递呈细胞吞噬后，发生交叉激活，将抗原递呈给T细胞。它具有如下优点：能够充分模拟自然感染状态，在动物体内合成具有相应空间构象的蛋白，不仅可以激发机体产生体液免疫反应还能够诱导产生特异性的细胞免疫反应；和重组蛋白免疫相比，核酸疫苗可在DNA水平对密码子进行优化、修饰，能更好的保证抗原蛋白的纯度，而且成本低廉，稳定性好，同时可以避免蛋白免疫原半衰期短的缺陷而建立更有效的长期免疫应答；基因免疫通过扩增的基因序列来编码蛋白抗原，能够避免直接接触危险性较高的病原体。但核酸疫苗也存在着诸多缺点，其中最主要的是核酸疫苗研究和应用的对象主要为真核生物，而目的基因绝大多数来自于病毒或细菌等原核生物，而原核生物与真核生物在密码子使用偏好上
存在明显差异，这就导致了核酸疫苗的外源基因在真核细胞内不能高效地表达，不能有效地刺激机体的免疫系统产生应答。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺陷，提供一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列。本专利技术的另一目的在于提供一种携带tPA信号肽并进行密码子优化的SFTSV Gn的核酸疫苗。本专利技术的目的通过如下技术方案实现：一种含有野生型信号肽(WSP)的SFTSV糖蛋白Gn的原始基因序列，序列为SEQ ID NO.1。一种密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn的基因序列，序列为SEQ ID NO.2。一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.1的SFTSV Gn的基因序列插入到真核表达载体HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得。一种SFTSV糖蛋白Gn的核酸疫苗，由序列为SEQ ID NO.2的SFTSV Gn基因序列插入到真核表达载体Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点之间所得，其5’端连接tPA信号肽序列。所述的真核表达载体为pJW4303。本专利技术提供的基因修饰的SFTSV糖蛋白Gn基因序列及其核酸疫苗的构建步骤如下：(1)含WSP信号肽的SFTSV Gn原始序列基因片段的获得以SFTSV HB29株为参考序列(GenBank:HM745931.1)，选取含WSP信号肽的糖蛋白Gn编码基因(即优化前的原始序列SEQ ID NO.1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pUC57，即pUC57-WSP-Gn。设计引物WSP-Gn-F：CCCAAGCTTATGATGAAAGTCATCTGG(SEQ ID NO.3)；WSP-Gn-R：GAGCTCGGATCCC TAT TACTCAATCCTAACATCATC(SEQ ID NO.4)。通过PCR扩增，分别引入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点。扩增产物用HindⅢ和BamH Ⅰ双酶切，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为含有WSP信号肽的原始序列的SFTSV糖蛋白Gn基因序列，两端分别连接有HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点，以便于核酸疫苗pJW4303-WSP-Gn的构建。(2)密码子优化的SFTSV糖蛋白Gn基因序列的设计和合成以SFTSV HB29株为参考序列(GenBank:HM745931.1)，首先选取含WSP信号肽基因的SFTSV Gn基因，全长1605bp，然后运用软件OptimumGeneTM分析其基因序列，找出其密码子使用偏好同时找出与哺乳动物密码子使用偏好不同的密码子位点，用哺乳动物偏好的密码子替代
SFTSV糖蛋白Gn基因中使用偏好不同的密码子，然后设计出密码子优化的SFTSV Gn基因序列，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并装入载体pUC57，即pUC57-WSP-Gn-opt。密码子优化的基因序列所编码的蛋白质氨基酸序列与原有的氨基酸序列保持一致。密码子优化后的SFTSV Gn基因序列为SEQ ID NO.2。(3)携带tPA信号肽并密码子优化后的SFTSV Gn基因片段的获得对南京金斯瑞生物科技有限公司提供的含有目标序列的重组载体pUC57-WSP-Gn-opt，设计引物tPA-Gn-opt-F：GTCACTTCGCTAGCGACAGTGGACCTATTATCTGCG(SEQ ID NO.5)；tPA-Gn-opt-R：GAGCTCGGATCCCTATTACTCAATCCGCACATCGTCC(SEQ ID NO.6)。通过PCR扩增，在优化Gn序列的5’端和3’端分别引入酶切位点Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ，将Gn-opt基因序列连在质粒pJW4303的tPA信号肽序列下游。扩增产物用Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，并用DNA凝胶回收试剂盒(Omega Agarose Gel DNA Purification Kit，美国Omega公司)回收纯化目的片段，该片段为优化的SFTSV Gn基因序列，两端分别连接有Nhe Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点，以便于核酸疫苗pJW4303-tPA-Gn-opt的构建。(4)将步骤(1)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-WSP-Gn。将步骤(3)得到的基因片段克隆到真核表达载体pJW4303中，得到重组质粒pJW4303-tPA-Gn-opt。经对重组质粒抽提、酶切、测序后，确定得到了与预期相符的质粒，即为本专利技术所述的SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗。本专利技术的有益成果：SFTSV是一种新发现的病原体，目前对其基因组编码的各种蛋白尤其是Gn的生物学特性、在疾病发生发展过程中的作用、其抗体是否合适临床及流行病学运用等都尚不清楚。此外，由于自然界生物体存在密码子的偏好性，从病原体来源的SFTSV本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)糖蛋白Gn基因序列，序列为SEQ ID NO.2。
【技术特征摘要】
1.一种密码子优化的严重发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)糖蛋白Gn基因序列，序列为SEQ ID NO.2。2.一种SFTSV糖蛋白Gn核酸疫苗，其特征在于由序列为SEQ ID NO.2的SFTSV...
【专利技术属性】
技术研发人员：李军，金柯，刘源，徐菱遥，韩亚萍，刘艳，周宜庆，
申请(专利权)人：李军，金柯，刘源，徐菱遥，韩亚萍，刘艳，周宜庆，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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