一种猪瘟病毒基因重组腺病毒冻干疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒冻干疫苗，本发明专利技术所用的疫苗抗原是根据猪瘟病毒天然保护性抗原的不同特性，人工将有利于制备疫苗的基因片段进行筛选并改造连接出新的抗原基因片段，同源重组到人5型复制缺陷型腺病毒载体中制备而成，该疫苗抗原免疫效果好，同时，其复制缺陷的特性保证了疫苗的安全；本发明专利技术所用的耐热保护剂能最大限度地减少制品在分装及冻干过程中各种理化因素对病毒活性的损伤，使冻干前后病毒的效价损失较少。本发明专利技术的耐热保护剂活疫苗耐老化程度高，在37℃条件下保存10天病毒的损失率不超过0.2个滴度，在2～8℃条件下保存36个月后，疫苗效价仍不发生明显改变，从而有效的延长了疫苗的保存期限。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒疫苗制备
，具体设及一种猪攝病毒基因重组腺病毒冻干 疫苗及其制备方法。
技术介绍
猪攝（CSFO是由猪攝病毒（ClassicalswinefevervirJiS，CSFV)引起的一种 猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪攝已被世界 动物卫生组织（01巧列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床W稽留高 烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物 疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪攝兔化弱毒株（又称C 株）疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪攝在我国乃至世界范围内大规 模的流行。猪攝C株弱毒疫苗是目前国内外广泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社 会认可。但其受母源抗体干扰，导致免疫失败的现象时有报道，接种此弱毒疫苗产生的抗体 无法与野毒感染产生的抗体相区分，给免疫的制订和国家猪攝防控净化也带来了巨大的挑 战，制约着我国生猪及猪肉制品在非免疫国家和地区的贸易发展。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种猪攝病毒基因重组腺病毒冻干疫苗及其制备方法，即一 种耐热型猪攝病毒基因重组腺病毒冻干疫苗。 本专利技术首先提供一种能用于制备猪攝病毒基因重组腺病毒的基因片段，其核巧酸 序列为SEQIDNO: 1;编码出新的氨基酸序列为SEQIDNO:2,使其抗原性更好。 本专利技术还提供一种猪攝病毒基因重组腺病毒，是将上述的基因片段同源重组到人 5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备的。 本专利技术制备的猪攝病毒基因重组腺病毒用于制备疫苗； 本专利技术另一方面提供了一种冻干疫苗，是用上述的猪攝病毒基因重组腺病毒作为 抗原加上疫苗耐热保护剂来制备的； 使用的疫苗保护剂的组成如下：2. 5~3. 5%NZ-胺、0. 2~0. 4%谷氨酸单钟盐、 15~25%薦糖、1. 5~2. 5%水解乳蛋白、4~6%明胶、2~8%甘油；余量为水。 上述的保护剂中还加入了青霉素、链霉素和抗支原体药物，其终浓度分别为青霉 素1001M/ml，链霉素80yg/ml，抗支原体药物为5yg/ml。 上述的耐热冻干保护剂，其制备方法如下： 1)首先称取NZ-胺、谷氨酸单钟盐、薦糖和水解乳蛋白，溶解后过滤除菌制成过滤 液；所用的微孔滤膜孔径为0. 1ym; 2)称取明胶加入到70-80°C注射用水中，揽拌直至完全溶解，加2-8%甘油一起高 压灭菌制成明胶溶液；明胶的浓度优选为W/V为25%;高压灭菌条件为116°C，20min; 3)将步骤1)制备的过滤液和步骤2)的明胶溶液4 :1混合后，制成冻干保护剂。本专利技术所用的疫苗抗原是根据猪攝病毒天然保护性抗原的不同特性，人工将有利 于制备疫苗的基因片段进行筛选并改造连接出新的抗原基因片段，同源重组到人5型复制 缺陷型腺病毒载体中制备而成，该疫苗抗原免疫效果好，同时，其复制缺陷的特性保证了疫 苗的安全；本专利技术所用的耐热保护剂能最大限度地减少制品在分装及冻干过程中各种理化 因素对病毒活性的损伤，使冻干前后病毒的效价损失较少，不超过1个滴度；本专利技术的耐热 保护剂活疫苗耐老化程度高，在37°C条件下保存10天病毒的损失率不超过0. 2个滴度，在 2~8°C条件下保存36个月后，疫苗效价仍不发生明显改变，从而有效的延长了疫苗的保存 期限。本专利技术的耐热冻干保护剂不仅耐热性能好、能有效保护病毒的活性，而且还具有配方 成分及配置方法简单、成本低、可实现大批量生产等优点，降低了生产成本。【具体实施方式】 申请人在猪攝活疫苗的研究基础上，利用人5型腺病毒基因组作为骨架构建了感 染性分子克隆，在其基因组的多克隆位点区插入所筛选出CSFV的基因抗原优势区（共585 个氨基酸）。获得的重组病毒在细胞上连续传了 60代，插入的外源基因片段没有发生任何 突变或丢失，而且通过免疫巧光检测到外源基因稳定表达，且提供的保护性和脾淋苗无差 异，并且具有腺病毒特征性基因，能够和疫苗毒与野毒感染相区分，同时能区分CSFV和脾 淋苗（包括野毒）的鉴别诊断方法已经建立。此疫苗一旦投入使用，不但可W通过抗体鉴 别技术区分疫苗免疫动物和野毒感染动物，极大地促进CSFV的净化或根除，可提高猪的存 活率，增加猪的存栏量和出栏量，对猪肉市场上相关畜产品的供应和稳定物价具有重要的 意义。 冻干活疫苗是预防畜禽传染病的主要疫苗之一，国内疫苗企业常用的冻干保护剂 主要是薦糖、脱脂奶粉和薦糖、明胶简单配比，组方简单，保护性差。如果在2~8°C条件下 保存，保存期只有短短3~6个月，大约需要在-20°C条件下保存。运就要求疫苗在保存、运 输和使用过程中尽可能在低溫条件下进行，否则疫苗的效价就会大打折扣。在疫苗生产、运 输和使用过程中，如果任何一个环节的冷链系统控制不当，高溫环境就会导致疫苗效力下 降，最终因免疫失败而造成疫病的流行。冻干保护剂可能影响生物制品的质量、效价和稳定 性，耐热保护剂有免疫活性而无药理活性，它不仅具有保护制品生物学活性的作用，而且具 有赋形剂和抗氧化剂的作用，直接与疫苗的滴度和稳定性相关联，可在冻干保存时维持疫 苗的稳定性，确保制品在2~8°C条件下，保存期可长达36个月，效价无明显下降，即使在 37°C条件下也可W保存十天W上。从而解决了常规疫苗在长途运输、长期保存和使用过程 中不耐热、储存溫度低、保存期短和苛刻的冷冻条件造成大量能源浪费等难题。但目前使用 的冻干保护剂用于猪攝病毒基因重组腺病毒疫苗的保存效果并不好。 在疫苗冻干保护剂制备领域中，保护剂组分的选择及配比对疫苗的保存效果具有 重要影响。为了使本专利技术的猪攝病毒基因重组腺病毒疫苗能够长期保存，申请人对本专利技术 冻干保护剂的组分进行了长期的研究，并优化了彼此间的配比浓度，从而使各组分之间具 有最大的复配效果。[001引对于本专利技术冻干保护剂所使用的组分，其性质如下：[001引1.NZ胺（NZ-AmineAS)，又称为罗蛋白的酶促水解物； 2.谷氨酸单钟盐a-谷氨酸钟盐）：是一种表面活性剂，可降低界面的张力，在冻 结和脱水过程中既能降低冰、水界面张力所引起的冻结和脱水形变，又能在复水过程中对 活性组分起到润湿剂作用。 3.水解乳蛋白又称水解乳清蛋白，是蛋白酶水解浓缩乳清蛋白或乳白蛋白的产 物，含足量的必须氨基酸。 4.薦糖具有渗透作用，能抑制有害微生物生长，延长产品保藏期，具有很好的水溶 性。微生物存活率，形成均一悬液，起到水分缓解作用，可防止活性组分变性。 对于本专利技术的冻干保护剂组分描述如下，NZ-胺、谷氨酸单钟盐和明胶均购自 Sigma公司，水解乳蛋白购自GIBC0,薦糖购自德国默克公司。 本专利技术的猪攝病毒基因重组腺病毒为实验室利用人5型复制缺陷型腺病毒载体 连接猪攝病毒的基因构建而成的新型疫苗毒株。下面对本专利技术的冻干疫苗进行详细的描述。 实施例1:猪攝病毒基因重组腺病毒的制备 通过对猪攝石口系强毒（CSFV)的基因组序列进行分析，得到了具有抗原性的核 巧酸片段，其核巧酸序列为SEQIDNO: 1，编码的氨基酸序列为SEQIDNO: 2。将筛选的基因 克隆入PET32a(+)多克隆酶切位点，转化D册a大肠杆菌，涂氨节抗性平板，挑取单本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能用于制备猪瘟病毒基因重组腺病毒的基因片段，其特征在于，所述的基因片段的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张恒，张小苗，孙永科，李卫华，胡潇，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37