一种利用整合子系统定点、定向的基因重组方法技术方案

本发明专利技术属生物技术领域，涉及一种利用整合子系统定点、定向的基因重组方法，采用整合子系统作为工具，首先构建在多克隆位点两侧含有attC序列的工具载体，然后将目的基因克隆到该载体，目的基因在宿主菌表达整合酶的情况下，能够定点且定向地插入到大肠杆菌基因组DNA中的attI位点。本方法简便易行，不需要特殊的仪器和试剂，仅需要4天时间就可将目的基因插入到宿主菌的染色体DNA中。所述的整合子系统作为分子生物学工具具有良好的应用前景，可用于获取含有目的基因的大片段DNA；同时，目的基因插入到宿主染色体定点且定向的特性，有助于解决在基因治疗中目的基因插入基因组DNA的靶向性问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物
，涉及一种基因重组的方法，具体涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地进行基因重组的方法。
技术介绍
已知在生物技术研究中，将目的基因插入到染色体基因组DNA，可以采用同源重组的办法或使用转座子的方法，但实践表明，同源重组的效率较低，操作麻烦，并且由于目的基因的插入而使原有基因遭受破坏；使用转座子的方法，也存在插入到染色体的部位是随机的，而且操作使用的转座酶价格昂贵等缺陷。整合子由于其与细菌的多重耐药性有关而得到广泛的关注。近年来在非临床菌株中发现有整合子的存在，其分布范围要比预期广得多。目前，本领域的有关学者主张将整合子作为细菌基因进化的有力工具。通常，一个整合子至少包括三个最基本的元件编码属于酪氨酸重组酶家族的整合酶的基因，位于整合酶编码区而与整合酶编码方向相反的驱动下游基因盒表达的启动子PC，整合酶所识别的重组位点attl。基因盒由一个通常无启动子的开放读码框和3'端整合酶重组识别位点attC构成。整合酶通常催化三种类型的重组反应attl X attl、attl X attC、attCX attC，其中attl X attC之间的重组效率比另外两种高得多，在此，由于attC序列具有一定的方向性，因而使得整合到attl位点的基因盒与Pc启动子方向一致而使其相应的基因得到有效的表达。研究表明，数个基因盒可以同时存在于一个整合子中，其相应基因的表达水平通常与其在整合子中的位置有关。距离Pc启动子越近的基因盒其表达水平越高，因此插入到attl位点的基因盒表达水平最高。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种简便、快速的基因重组的方法，具体涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地进行基因重组方法，尤其涉及一种利用整合子系统将目的基因定点且定向地插入到大肠杆菌染色体的基因重组方法。本专利技术利用含有目的DNA片段的基因盒插入到整合子的attl位点时表达水平增高的原理，对阳性克隆进行筛选。本方法采用整合子系统作为工具，首先构建在多克隆位点两侧含有attC序列的工具载体，然后将目的基因克隆到该载体，目的基因在宿主菌表达整合酶的情况下，能够定点且定向地插入到大肠杆菌基因组DNA中的attl位点。实践证明，本方法简便易行，只需常规简单的基因克隆操作，仅需要4天时间就可以将目的基因插入到宿主菌的染色体DNA中。所述的整合子系统作为分子生物学工具具有良好的应用前景，例如可用于获取含有目的基因的大片段DNA ；同时，目的基因插入到宿主染色体定点且定向的特性，在基因治疗中将有助于解决目的基因插入到基因组DNA的靶向性问题等。本专利技术通过下述技术方案和方法实现1、通过PCR扩增获取目的基因；2、通过下述步骤制备工具载体构建工具载体pACZC，其特征是在来源于pUC19质粒(TaKaRa)的LacZ基因的两侧引入整合酶识别重组序列attC，将该片段克隆到pACYC184质粒(J Bacteriol, 1978，134 1141-1156.)，该重组质粒命名为pACZC，利用其上LacZ上的多克隆位点，将任意DNA片段装配成基因盒结构。在上述PACZC质粒的LacZ编码区加入筛选标志基因aadA2，其编码对链霉素的抗性，该重组质粒命名为pACAZC。3、定点、定向地将目的基因插入到大肠杆菌的染色体中将高表达整合酶的质粒pUCINT(中华检验医学杂志，2007，30 =1398-1400)转化菌株DHS (专利申请号=200810033538. 7)，在该株细菌的染色体DNA的已知位点含有整合酶识别重组序列attl，转化后的细菌命名为DHSl ；将目的基因克隆到工具载体pACAZC的多克隆位点，转化DHSl菌株，利用整合酶催化高效率的attC位点和位点attl位点之间的重组反应，以及其对attC位点识别的方向性，实现目的基因定点且定向地插入到DHSl菌株染色体 DNA的attl位点。利用筛选标志基因aadA2插入到attl位点时获得整合子的固有启动子 Pc而高效表达，在含有链霉素的LB琼脂平板中筛选得到阳性克隆。为消除aadA2基因背景表达造成的假阳性克隆，使用PCR技术对筛选到的阳性克隆作进一步的鉴定。采用本专利技术建立的方法及配套工具载体，在不使用特殊设备和试剂的情况下，仅用4天时间就可以把目的基因定点且定向地插入到大肠杆菌染色体。本方法简便、快速、成本低廉，可应用于分子生物学技术。附图说明图1是目的基因插入到DHSl菌株基因组DNA的流程图，其中，在HSl菌株中的矩形标志表示目的基因在染色体上的插入位点，在筛选到的阳性克隆中较小的矩形标志表示插入到大肠杆菌基因组的目的基因。图2是重组质粒pACZC的结构示意图，其中，attCs和attCe是整合酶所识别的重组序列，其中attCs端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时靠近attl位点，而attCe端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时远离 attl位点，为克隆目的基因可采用的限制性酶切位点有HindIII、PSt I、Sse8387I、Sma I、 KpnI、Sac I、Pvu I、Nde I、Apal I。图3是重组质粒pACAZC的结构示意图，其中，attCs和attCe是整合酶所识别的重组序列，其中attCs端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时靠近attl位点，而attCe端的序列在整合到大肠杆菌的染色体时远离 attl位点，aadA2为编码链霉素抗性筛选标记的基因，AAFQ为用于筛选阳性克隆所用的引物，为克隆目的基因可采用的限制性酶切位点有Xho I、Bgl II、Mlu I、Apa I, Sma I, Kpn I、Sac I、Pvu I、Nde I、Apal I。图4是筛选阳性克隆用扩增曲线，其中，A为从链霉素平板上挑选的三个含有质粒pACSA2的DHSl菌落为模板的扩增曲线；B为从链霉素平板上挑选的三个含有质粒pACSAll的DHSl菌落为模板的扩增曲线； 1、2、3分别为菌落编号。图5是扩增产物的融解曲线图，其中，A图对应于图4. A扩增产物的融解曲线，B图对应于图4. B扩增产物的融解曲线，1、2、3分别为菌落编号。图6是PCR扩增产物的电泳图，其中，A图为以筛选出的在染色体DNA已插入200pb的菌落为模板的PCR扩增产物的电泳图，B图为以筛选出的在染色体DNA已插入1. Ikb的菌落为模板的PCR扩增产物的电泳图。图7表示将图6A 1泳道的扩增产物切胶纯化后的测序结果，划线部分序列与引物 SA2 一致。图8表示将图6B 1泳道的扩增产物切胶纯化后的测序结果，划线部分序列与引物 SAll 一致。具体实施例方式实施例1构建工具载体pACAZC，其通过下述步骤实现(1)用重叠PCR技术构建含有attCs-LacZ-attCe基因盒的重组质粒pACZC，构建过程如下述attCs 的扩增体系为去离子水 18. 88 μ 1，IOXbuffer 2. 5 μ 1, dNTP 2. 0μ 1, 引物 AADL 0. 5μ 1，引物 LAP2N 0. 5μ 1, Pyrobest DNA 聚合酶(TaKaRa)O. 12 μ 1，148 号菌株基因组DNA 0. 5 μ 1 (该菌株含有的整合子序列与pCTX-M3质粒上的整合子的序列相同，GenBank 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组质粒PACZC，其特征是具有序列1的结构，该重组质粒通过在LacZ基因两端引入整合酶所识别的重组序列attCs和attCe，克隆到质粒pACYC184后，得重组质粒 pACZCο2.一种重组质粒pACAZC，其特征是具有序列2的结构，该重组质粒通过在重组质...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕元，杨泽华，关明，魏取好，陈楠，
申请(专利权)人：复旦大学附属华山医院，
类型：发明
国别省市：