一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒制造技术

本发明专利技术提供一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl?II和Kpn?I酶切位点中插入猪瘟病毒E0基因，在XhoI和Xba?I酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。它解决了E0、E2基因融合串联表达产量低和保护效果弱的问题，仅通过一次免疫接种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体，且生产成本是常规疫苗的一半，本重组腺病毒属于非复制型病毒，在猪体内不繁殖，解决了弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖，毒力增强的现象。本重组腺病毒仅含有猪瘟病毒的主要保护基因，不含病毒的其它基因，因此，与野毒株之间不会发生重组。用本重组腺病毒制成的疫苗，免疫猪后对致死量100倍TCID50的猪瘟病毒强毒攻击的保护效果为100％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组腺病毒，尤其是一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒EO基因和E2基因的重组腺病毒，属于生物

技术介绍
猪瘟是一种传染性非常强的传染病，常给养猪业造成毁灭性损失。目前，免疫接种仍是猪瘟防治的主要措施，而且是根除猪瘟病和阻止野毒传向无猪瘟病猪群的必要手段。 猪瘟疫苗无论在过去、现在还是将来，对控制和消灭猪瘟病都具有极其重要的作用，各国学者对猪瘟疫苗的研制和开发一直没有放弃。传统的猪瘟疫苗有灭活疫苗和弱毒疫苗，其中灭活苗免疫效力低，保护期短，激发机体产生免疫力的速度慢，到目前为止，组织培养猪瘟毒的产量以及灭活疫苗所造成的病毒有效抗原的损失，仍是制造灭活疫苗的二大障碍；猪瘟弱毒疫苗的广泛应用，对于控制猪瘟的流行起到了关键作用，但是弱毒疫苗也存在下列不足首先近年来猪瘟的流行特点发生了很大的变化，呈现周期性、波浪形的地区性散发和温和性猪瘟病，发病后的临床症状有无名高热、症状不典型、持续性感染、出生仔猪先天性震颤和母猪繁殖性障碍，用传统疫苗免疫常常造成免疫失败，即使将剂量增加到750个兔体反应(国家规定150个兔体反应)也不能预防其感染，而且有蔓延的趋势，在妊娠早期接种疫苗还会发生疫苗毒通过胎盘感染胎儿，造成死胎或弱仔并成持续性带毒者，产生新的疫源；其次，弱毒疫苗已经沿用了近40年，猪瘟的流行形式发生了很大变化，说明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测，发现有不同的反应模式，表明经过多年在不同细胞上的驯化，C-株已经产生变异，这种流行毒株的变化趋势国内外情况基本一致，流行毒往往逃避免疫，导致免疫失败的严重后果；第三，接种弱毒疫苗还会影响到国际贸易，欧盟已禁止使用猪瘟弱毒疫苗，而采用严格的卫生防疫制度， 扑杀猪瘟感染猪和血清学阳性猪来控制和消灭猪瘟，采用扑杀政策需要大量的人力、物力和巨额资金，发展中国家是难以承受的，这就促使人们研究和开发新型的猪瘟疫苗来防控本病。近年来，基因工程技术的迅猛发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发提供了工具，目前， 猪瘟基因工程疫苗的研制已经成为新的研究方向和热点。人-5型腺病毒载体与其他动物病毒载体相比，具有许多优点首先是安全，腺病毒毒性低，基本不致病或只引起轻微的症状，腺病毒重组后，毒力进一步降低，并且克服了逆转录病毒载体因随机整合可能导致插入突变的潜在风险；其次是宿主范围广，腺病毒可感染多种细胞包括分裂与非分裂细胞；第三是稳定，腺病毒粒子十分牢固，不易突变，并且容易大量制备并纯化，得到高滴度的病毒，在体外可获得IOllPfuAiL ；第四就是对于腺病毒基因组的结构和功能目前研究得比较清楚，基因操作方便；第五是插入外源基因容量大，在基因治疗构建重组疫苗中大多采用缺失El和E3区基因的腺病毒载体，通常复制缺陷型腺病毒可容纳约71Λ 81Λ的外源基因，比逆转录病毒和腺相关病毒的容量大很多；还有就是免疫途径简便，腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，疫苗接种简便，可口服或气雾吸入而不需注射，并且经口服后能产生局部黏膜免疫应答，在免疫方法上比其它疫苗好，容易推广使非复制型腺病毒不仅更安全有效，而且以低剂量的方式产生抗原蛋白而不裂解细胞，故表达抗原的时间更持久，有利于激发长期的免疫反应。目前，已经有多种产品已经上市，例如“安柯瑞——重组人5型腺病毒注射液”；“重组人Y-干扰素腺病毒注射液 (ElOB) ”;“今又生(重组人p53腺病毒注射液)”;“人禽流感重组腺病毒疫苗临床前安全评价方法的研究”取得阶段性成果；“重组腺病毒-胸苷激酶基因制剂”；另外“猪繁殖与呼吸综合征重组腺病毒和疫苗”已经被南京农业大学申请专利。
技术实现思路
为解决猪瘟弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖、毒力增强的现象和弱毒疫苗株与野毒发生重组等问题，以及猪瘟病毒E0、E2基因融合串联表达存在的产量低和保护效果弱的问题，本专利技术提供一种能在同一腺病毒中表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒。本专利技术提供的是这样一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和KpnI酶切位点中插入猪瘟病毒EO基因， 在Bio I和^CbaI酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。所述猪瘟病毒为常规的市购病毒，猪瘟病毒的EO基因在GenBank中的登录号为 AF058715. 1，猪瘟病毒的E2基因在GenBank中的登录号为AY775178. 2所述腺病毒为常规的市购人-5型非复制型腺病毒。所述在腺病毒中同时分别表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，包括下列构建步骤A.从市购的猪瘟病毒和猪瘟病毒中分别扩增出EO和E2基因；B.将步骤A获得的猪瘟病毒EO基因通过BglII和KpnI酶切位点插入至腺病毒穿梭载体pAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-EO ；C.将步骤A获得的猪瘟病毒E2基因通过Kpn I和Not I酶切位点插入至腺病毒穿梭载体PAdTrack中，形成腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2 ；D.将步骤C的腺病毒穿梭载体pAdTrack-E2按常规的PCR方法扩增出含有CMV启动子的CMV-E2基因，通过Biol I和)(ba I酶切位点插入至步骤B的腺病毒穿梭载体PAdTrack-EO中的Biol I和)(ba I酶切位点中，形成重组腺病毒穿梭载体 pAdTrack-E0-CMV-E2 ；E.将步骤D的重组腺病毒穿梭载体pAdTrack-E0-CMV-E2经RiieI酶切线性化后， 转化到含有腺病毒骨架载体pAd-easy-Ι的大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，形成重组腺病毒骨架载体 pAd-easy-E0-CMV_E2 ；F.将重组腺病毒骨架载体pAd-eaSy-E0-CMV-E2经I3acI线性化后，转染人胚胎肾细胞HEK293中，包装出重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2。本专利技术具有下列优点和效果采用上述方案获得的重组腺病毒rAd-E0-CMV_E2，能在同一腺病毒中分别表达猪瘟病毒EO蛋白和猪瘟病毒E2蛋白，解决了 E0、E2基因融合串联表达产量低和保护效果弱的问题，本专利技术仅通过一次免疫接种就能够使免疫后的猪获得对猪瘟病毒的抗体，对猪瘟具有较强的抵抗能力，生产成本是常规疫苗的一半，大大降低了疫苗成本。本专利技术提供的重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2属于非复制型病毒，在猪体内不繁殖，解决了弱毒疫苗长期接种导致的病毒返祖，毒力增强的现象。本专利技术提供的重组腺病毒rAd-E0-CMV-E2仅含有猪瘟病毒的主要保护基因，不含病毒的其它基因，因此，本专利技术提供的重组腺病毒与野毒株之间不会发生重组。采用上述方案构建获得的重组腺病毒制成的疫苗，免疫猪后对致死量100 倍TCID5tl的猪瘟病毒强毒攻击的保护效果为100%。既解决了猪瘟疫苗和猪瘟野毒同源重组后毒力返强的问题，也解决了弱毒疫苗生产成本高的问题。附图说明图1为ELISA检测的猪瘟病毒抗体的水平。 具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。实施例A.猪瘟病毒EO基因和E2基因的扩增(I)PCR扩增引物的设计在猪瘟病毒EO基因的上、下游引物中分别加入Bgl II和Kpn I限制性内切酶酶切位点，所述猪瘟病毒EO基因的本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种表达猪瘟病毒Ｅ０、Ｅ２基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的ＣＭＶ启动子下游多克隆位点的Ｂｇｌ　ＩＩ和Ｋｐｎ　Ｉ酶切位点中插入猪瘟病毒Ｅ０基因，在Ｘｈｏ　Ｉ和ＸｂａＩ酶切位点中插入腺病毒ＣＭＶ启动子和猪瘟病毒Ｅ２基因的ＣＭＶ－Ｅ２片段。

【技术特征摘要】
1.一种表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于在腺病毒的CMV启动子下游多克隆位点的Bgl II和Kpn I酶切位点中插入猪瘟病毒EO基因，在Bio I和)(baI酶切位点中插入腺病毒CMV启动子和猪瘟病毒E2基因的CMV-E2片段。2.如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于所述猪瘟病毒为常规的市购病毒，猪瘟病毒的EO基因在GenBank中的登录号为AF058715. 1，猪瘟病毒的E2基因在GenBank中的登录号为AY775178. 23.如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒，其特征在于所述腺病毒为常规的市购人-5型非复制型腺病毒。4.一种如权利要求1所述的表达猪瘟病毒E0、E2基因的重组腺病毒的构建方法，其特征在于包括下列构建步骤A.从市购的猪瘟病毒和猪瘟病毒中分别扩增出EO和E2基因；B.将步骤A获得的猪瘟病毒EO基因通过BglII和Kpn I酶切位点插入至腺病毒穿梭载体pAdTrack中，形成腺病毒穿...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙永科，杨玉艾，
申请(专利权)人：孙永科，
类型：发明
国别省市：53