肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法技术

本发明专利技术提供肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法。本发明专利技术的目的在于，针对适于应用基因重组技术与合成生物学方法的大肠杆菌等不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物，赋予显著得到改善的肌肉肌醇生产能力。在本发明专利技术中，使下述转化体中的肌醇单磷酸酶活性增强，该转化体是在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的。

【技术实现步骤摘要】
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/JP2012/079182，国际申请日是2012年11月9日，中国国家申请号为201280050798.X，进入中国的日期为2014年4月16日，发明名称为“肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法”。
本专利技术涉及基因重组技术在肌肉肌醇的制造中的应用。特别是涉及利用原核微生物的转化体的肌肉肌醇的工业制造方法。本专利技术进一步涉及新颖的肌肉肌醇衍生物及其制造方法。
技术介绍
肌肉肌醇对于多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪和胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预防或治疗中是特别有效的。因而，对于以工业规模制造肌肉肌醇的制造工艺提出了多种改良方案。以往，肌肉肌醇是从米糠、玉米浆等直接提取的，但该提取方法中，肌肉肌醇的收率低，并且大量生成杂质，因而肌肉肌醇的精制困难，生产效率极低。因此，还有人提出了对具有肌肉肌醇生产能力的面包酵母进行培养，由该培养物中生成肌肉肌醇的方法，但该方法的生产率仍然较低，在经济上不成立，因而未进行工业实施。因而，对更加有效地生产肌醇的微生物进行了检索。专利文献1公开了可向菌体外分泌肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献2和3分别公开了在上述假丝酵母属酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢抵抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利文献4、5和6中还分别公开了通过在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对叔胺、六氯环己烷和十六烷基三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌醇的收率的内容。专利文献7中同样公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-卤代-6-脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。在专利文献8中还公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。进一步地，现有技术还记载了利用基因重组进行的酵母的转化。在专利文献9中公开了下述内容：在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应，在这一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA对不具有肌醇分泌能力的假丝酵母属酵母进行转化而对该酵母赋予肌醇生产能力。在专利文献10中公开了通过将置于甘油-3-磷酸脱氢酶基因启动子的调节下的编码肌醇-1-磷酸合成酶的DNA单独导入酵母，来提高该酵母的肌醇生产率的内容。进一步地，专利文献11中还涉及甲醇利用性酵母毕赤酵母进行肌醇生产的内容，其中公开了在该酵母中导入肌肉肌醇-1-磷酸合成酶基因并同时导入肌醇磷酸磷酸酯酶基因的内容，但未明确该追加的肌醇磷酸磷酸酯酶基因导入的意义和效果。因而，关于上述酵母的任一文献均是以在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应为前提的，并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除此以外的酶的重要性。另一方面，对于以大肠杆菌为代表的原核微生物，由于其旺盛的增殖能力及发酵管理中的各种优越性，与酵母相比，其为极富魅力的工业生产用生物。但是，具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不为人所知。因而，为了利用原核微生物进行肌肉肌醇的工业生产，在原核微生物宿主内构建外来性的肌肉肌醇生物合成通路为不可缺的。具体地说，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，下述催化剂活性为必要的：活性1：由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；活性2：将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；和活性3：以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酯酶活性。但是，由于作为活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸为原核微生物普遍产生的代谢中间体，因而对原核微生物赋予该活性并非为必须的。此外，对于活性3来说，就本专利技术人所知，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。此外，若对活性2进行观察，则多为原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。并且，如上所述，在肌肉肌醇生物合成反应中，认为肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应。因而，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，认为在该细胞中导入肌醇-1-磷酸合成酶基因是充分必要的。实际上，非专利文献1公开了肌肉肌醇在大肠杆菌转化体内的生产，但仅在该转化体中导入了肌醇-1-磷酸合成酶基因。专利文献12中还公开了在大肠杆菌宿主细胞中仅导入肌醇-1-磷酸合成酶基因来制作转化体、由此在该转化体内构建外来性肌肉肌醇生物合成通路的内容。但是，该文献的最终目的生成物为D-葡糖二酸，肌肉肌醇是作为中间体生产的。特别要指出的是，该文献中还记载了下述内容：“还应该注意到，本专利技术中的suhB基因或相同的磷酸酯酶并未过剩表达。但是，在培养产物中未检测出肌肉肌醇-1-磷酸，另一方面却蓄积了肌肉肌醇。因而专利技术人得出结论，磷酸酯酶活性并未限制通过通路的代谢流(flux)。”(第33页、第2～5行)。因而，现有技术并未公开或暗示肌醇单磷酸酶在通过重组微生物进行肌肉肌醇生产中的决定性作用。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开平8-00258号公报专利文献2：日本特开平8-38188号公报专利文献3：日本特开平8-89262号公报专利文献4：日本特开平9-117295号公报专利文献5：日本特开平10-42860号公报专利文献6：日本特开平10-42882号公报专利文献7：日本特开平10-42883号公报专利文献8：日本特开2000-41689公报专利文献9：日本特开平9-220093号公报专利文献10：日本特开平10-271995号公报专利文献11：日本特开2011-55722号公报专利文献12：WO2009/145838号小册子非专利文献非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.1999,Vol.121,3799-3800
技术实现思路
专利技术所要解决的课题对于不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，其具有容易调节肌肉肌醇生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主除了不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路以外，还不具有多数酵母所具有的肌醇同化能力(分解能力)，因而更容易应用合成生物学的方法。此外，对于大肠杆菌来说，由于其迅速的生长能力及发酵管理的容易性，从工业发酵生产的方面考虑其是极富魅力的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肌肉肌醇衍生物，其是下述结构式所表示的化合物：[化2]

【技术特征摘要】
2011.11.14 JP 2011-2484381.一种肌肉肌醇衍生物，其是下述结构式所表示的化合物：
[化2]
2.一种肌肉肌...

【专利技术属性】
技术研发人员：小西一诚，今津晋一，佐藤真弓，
申请(专利权)人：旭化成化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP