一种蝎神经毒素BjαIT基因及其重组蛋白的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种蝎神经毒素BjαIT基因及其重组蛋白的制备方法，主要包括以下步骤：（1）根据BjαIT成熟毒素的氨基酸序列和毕赤酵母表达系统的特点优化合成C‑端带有6×His标签的BjαIT的基因并构建毕赤酵母分泌表达载体；（2）转化重组载体到毕赤酵母宿主中，得到了高水平分泌表达的酵母转化子，经镍亲合层析法，快速得到了纯度达95%以上的重组蝎昆虫神毒素BjαIT蛋白。本发明专利技术探索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素BjαIT的方法，通过镍亲合层析快速获得取高纯度的重组蝎昆虫神毒素BjαIT蛋白，该蛋白在细胞和动物水平均表现出很强的生物活性，对于抗虫领域，特别是培育抗虫植物品种有重要的价值，对提高农作物的产量具有重要的意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种蝎神经毒素BjαIT重组基因及其蛋白的制备方法和应用。
技术介绍
昆虫神经毒素是一类只作用于昆虫神经系统，有毒杀作用的多肽类神经毒素，主要来自于蝎，其次来自蜘蛛。这类对昆虫有专一毒杀作用的毒素的作用位点是各种离子通道，具有高效昆虫专一性的神经毒素主要是作用于钠离子通道的长链神经毒素，这类长链神经毒素一般由60-70个氨基酸组成，有2-4对链内二硫键。不同种属来源的神经毒素在氨基酸的组成上没有明显的保守性，而同种来源神经毒素在一级结构上具有很高的保守性。BjαIT是一种从蝎子Buthotusjudaicus的毒液中分离到的一种对昆虫具有高度选择性的作用于钠离子通道的α-型昆虫神经毒素，该成熟神经毒素由64个氨基酸残基组成，对农业害虫具有很强的毒杀作用，天然毒素对蝗虫的半数瘫痪剂量(PD50)为50ng/g体重，因此该毒素具有重要抗虫价值。虽然，昆虫神经毒素具有控制农业害虫的重要潜在价值，但天然昆虫神经毒素在毒腺中的含量低且提取困难的，并且往往只能得到非常少量的纯品，这就给我们进一步研究这些毒素的特性带来了很大的困难。因此，通过分离少量昆虫毒素，测定其氨基酸组成，再得到其成熟基因全长，通过体外大量表达，成为研究这些毒素的一条重要途径。目前，人们已经开发了很多表达系统如：杆状病毒表达系统、原核表达系统、酵母表达系统、丝状真菌表达系统、昆虫细胞表达系统、植物表达系统、哺乳动物表达系统等，为大量制备该类神经毒素提供了有效手段。甲醇酵母表达系统是应用最广泛的酵母表达系统，以Pichiapastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。毕赤酵母系统的广泛应用，原因在于该系统除了具有一般酵母所具有的特点外，还具其它很多显著优点，如易操作、高密度发酵放大容易、成本低且可以高水平分泌。目前，还没有利用毕赤酵母表达系统高效表达并纯化活性BjαIT重组蛋白的相关报告，极大影响了BjαIT活性测定、杀虫谱分析及其在抗农业害虫中的应用，因此开发出一种利用毕赤酵母高水平分泌表达大量BjαIT蛋白并快速、低成本的制备具有生物活性的昆虫神毒素BjαIT蛋白是十分必要的。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术目的之一在于提供一种蝎神经毒素BjαIT重组基因。本专利技术提供基因，为编码蝎神经毒素BjαIT蛋白的基因，为序列表中序列1所示的DNA分子。其中，序列表中的序列1由213个脱氧核苷酸组成，该序列为包含6个组氨酸标签(18个脱氧核苷酸)的BjαIT基因读码框(192个脱氧核苷酸)和终止密码子，编码具有序列表中序列2的由70个氨基酸残基序列组成的蛋白质。由上述序列表中的序列1编码得到的蛋白属于本专利技术的保护范围。含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组载体具体为将上述基因插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。扩增所述基因全长或其任意片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。上述引物对中的一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列3，所述引物对中的另一条引物的核苷酸序列为序列表中的序列4，利用序列3和序列4的引物扩增的目标基因同样可以进行相关的酶切和连接操作。本专利技术的第二个目的是提供一种制备重组BjαIT蛋白的方法，包括以下步骤：S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA-BjαIT；S2：将所述重组载体pPICZαA-BjαIT用SacⅠ单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将所述阳性克隆转接至含有2000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导3d，收集发酵的上清液；在诱导表达之前，优选地将高Zeocin抗性的转化子用BMMY小量诱导表达，筛选得到高水平分泌表达目标蛋白的转化子。优选地，在步骤S3的诱导3d之后且收集发酵的上清液之前，还包括进一步诱导表达的如下步骤：S4：在28°C继续诱导培养3d，每24小时补加甲醇使其质量分数保持在1~2%。优选地，在步骤S3之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：S5：将所述上清液利用Tris碱调节pH至7.5~8.0，以大于或等于15000g的转速离心10~20分钟，将获得的上清液加入到pH7.5~8.0Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用3~5倍层析柱体积的pH7.5~8.0的含10mMTris-HCl和30~50mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；S6：用含10mMTris-HCl和100~400mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为3kDa的透析袋于10mMTris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。优选地，在步骤S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80°C下速冻，然后冷冻干燥。根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本专利技术的保护范围。通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达蝎昆虫神经毒素BjαIT的酵母转化子也属于本专利技术保护的范围。上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在抗虫领域中的应用也是本专利技术保护的范围。本专利技术提供的技术方案具有以下优点：一是根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组蝎昆虫神经毒素BjαIT能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pPICZαA-BjαIT上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持蝎昆虫神经毒素BjαIT的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得蝎昆虫神经毒素BjαIT的酵母转化子；四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达昆虫神毒素BjαIT的方法和快速高效纯化蝎昆虫神经毒素BjαIT的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是纯化的带组氨酸标签的重组蛋白对昆虫细胞有昆虫细胞和农业害虫具有显著生物活性。本专利技术的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本专利技术的实践了解到。附图说明图1为本专利技术实施例中的表达载体pPICZαA-BjαIT构建示意图；图2为本专利技术实施例中的pPICZαA-BjαIT酵母转化子的PCR检测结果的电泳图；图3为本专利技术实施例中高水平与低水平分泌表达BjαIT重组蛋白的转化子上清液中目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图4为本专利技术实施例中在甲醇诱导下不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图；图5为本专利技术实施例中不同浓度的咪唑洗脱纯化得到的BjαIT蛋白的SDS-PAGE检测结果图；图6为本专利技术实施例中纯化的BjαIT蛋白的SDS-PAGE检测本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经过优化和筛选的BjαIT基因，是由序列表中序列1所示编码具有毒杀昆虫活性蛋白的DNA分子。

【技术特征摘要】
1.一种经过优化和筛选的BjαIT基因，是由序列表中序列1所示编码具有毒杀昆虫活性蛋白的DNA分子。2.根据权利要求1所述的DNA分子编码得到的序列表中序列2所示一种蛋白质分子。3.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体具体为将权利要求1所述的基因插入表达载体中，得到表达权利要求2所述蛋白的重组载体，所述重组载体具体优选为将上述基因插入表达载体pPICZαA的XhoⅠ和XbaⅡ酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。4.一种利用权利要求1所述的基因制备蛋白的方法，包括以下步骤：S1：将权利要求1所述的基因和表达载体pPICZα分别用XhoⅠ和XbaⅠ双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16°C连接，得重组载体pPICZαA-BjαIT；S2：将所述重组载体pPICZαA-BjαIT用SacⅠ单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；S3：将所述阳性克隆转接至含有2000μg/mLZeocin的YPD平板，筛选得到高Zeocin抗性的转化子，将所述高抗性转化子用BMGY培养基培养至OD600为10~15，离心收集细胞沉淀，用BMMY培养基重悬细胞，加入甲醇并使其质量分数为1~2%，诱导3d，...

【专利技术属性】
技术研发人员：李洪波，夏玉先，
申请(专利权)人：怀化学院，
类型：发明
国别省市：湖南;43