本发明专利技术公开了一种调控性CIAPIN1基因重组腺病毒及其制备方法和应用，该重组腺病毒是将一个CIAPIN1基因表达盒插入复制缺陷5型腺病毒基因组中而得到，CIAPIN1基因表达盒由Survivin启动子、CIAPIN1基因和终止子组成，CIAPIN1基因的表达受Survivin启动子调控；该重组腺病毒具有较强的选择性和特异性，通过肿瘤特异性Survivin启动子调控CIAPIN1基因的表达，能够使CIAPIN1基因选择性地表达于神经胶质瘤细胞中，发挥抑制细胞克隆、诱导细胞凋亡的作用，在准确杀伤神经胶质瘤细胞的同时减少正常组织细胞的损伤，体内实验显示其能够有效抑制神经胶质瘤细胞的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，因此，可用于制备神经胶质瘤治疗药物，在神经胶质瘤基因治疗领域有着较好的开发应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物基因工程领域，涉及一种基因重组腺病毒，特别涉及一种调控性 CiAPim基因重组腺病毒，还涉及该重组腺病毒的制备方法和应用。
技术介绍
神经胶质瘤是威胁人类健康的重要疾病，其治疗新方法的研究一直是医学和生命科学研究的重点。神经胶质瘤的生物治疗已被世界医学界公认为是继手术、放疗和化疗之后的第四大治疗方法，其中基因治疗更是目前肿瘤生物治疗中最活跃的研究领域之一。神经胶质瘤基因治疗的原理是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞，使靶细胞表达此基因而获得特定的功能，继而执行或介导对肿瘤的杀伤和抑制作用，从而达到治疗之目的。细胞因子诱导的凋亡抑制因子1 (cytokine induced apoptosis inhibitorl, CIAPIN1)是新近发现的一个细胞因子依赖性抗凋亡分子，并已经被证实是独立于凋亡调节分子Bcl-2家族、caspase家族等之外的Ras信号转导通路中的另一个调节分子。从目前的研究结果来看，一方面CIAPim在不同组织来源的恶性肿瘤中表达水平存在明显差异，使得CIAPim在相应肿瘤的发生过程及增殖凋亡过程中发挥的作用不同；另一方面CIAPIN1 参与了肿瘤多药耐药的发生及逆转。因此，CIAPim基因的生物学功能仍未明了，内源性和外源性CIAPim基因可能发挥不同的功能，CIAPim与肿瘤的发生可能与多基因、多因素有关。迄今为止，国内外尚未见有关调控性CIAPim基因重组腺病毒及其在神经胶质瘤治疗领域应用的研究报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种调控性CIAPim基因重组腺病毒，通过肿瘤特异性启动子调控CIAPim基因的表达，使CIAPim基因能选择性地表达于肿瘤细胞中，从而在准确杀伤肿瘤细胞的同时减少正常组织细胞的损伤；目的之二在于提供所述调控性CiAPim基因重组腺病毒的制备方法；目的之三在于提供所述调控性CiAPim基因重组腺病毒在神经胶质瘤治疗领域中的应用。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案1、调控性CIAPim基因重组腺病毒，系将一个CIAPim基因表达盒插入复制缺陷5型腺病毒基因组中而得到，所述CIAPim基因表达盒由Survivin启动子、CIAPIN1基因和终止子组成，所述CIAPim基因的表达受Survivin启动子调控。2、调控性CIAPim基因重组腺病毒的制备方法，包括以下步骤a、Survivin启动子的克隆根据Survivin基因启动子片段的核苷酸序列设计并合成引物，以神经胶质瘤细胞U251基因组DNA为模板，PCR扩增两端分别带有Bio I酶切位点和Nco I酶切位点的Survivin启动子片段，将其克隆入pGEM_T载体，得重组载体pGEM_T/ SurvivinP ；b、ciAPmi基因的克隆根据CiAPim基因的核苷酸序列设计并合成引物，将人胚胎肾293细胞总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，PCR扩增两端分别带有Hind III 酶切位点和BamH I酶切位点的CIAPim全长cDNA，将其克隆入pMD18_T载体，得重组载体pMD18-T/CIAPim ；再自重组载体pMD18_T/CIAPmi中用Hind III和BamH I双酶切出 CIAPim全长cDNA，与同样经Hind III和BamH I双酶切的真核表达载体pcDNA3. 1 (+)在 T4 DNA连接酶的作用下连接，得重组载体pcDNA3. 1-CIAPIN1 ；c、调控性CIAPim基因重组腺病毒穿梭载体的构建自步骤a所得重组载体pGEM-T/ SurvivinP中用Xho I和Nco I双酶切出Survivin启动子片段，与同样经Xho I和Nco I 双酶切的步骤b所得重组载体pcDNA3. I-CIAPim在T4 DNA连接酶的作用下连接，得重组载体 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl ；再自重组载体 pcDNA3. I-SurvivinP-CIAPINl 中用 Xho I和BamH I双酶切出SurvivinP-CIAPINl片段，与同样经Xho I和BamH I双酶切的腺病毒穿梭载体PShuttle在T4 DNA连接酶的作用下连接，得重组腺病毒穿梭载体pShuttle-SurvivinP-CIAPINl ；d、调控性CIAPim基因重组腺病毒载体的构建将步骤c所得重组腺病毒穿梭载体paiuttle-SurvivinP-CIAPim用Rne I酶切使线性化后，与腺病毒骨架载体 PAdEasy-I共转染大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行胞内同源重组，得重组腺病毒载体 pAd-SurvivinP-CIAPINl ；e、调控性CIAPim基因重组腺病毒的包装、扩增和纯化用脂质体法将步骤d所得重组腺病毒载体pAd-SurvivinP-CIAPim转染293细胞，待细胞出现明显病变时，离心收集细胞，反复冻融使细胞裂解，离心去除细胞碎片，收集含病毒的上清液，得重组腺病毒 Ad-SurvivinP-CIAPINl原液；将病毒原液再感染293细胞以扩增病毒，所得含病毒上清液采用氯化铯梯度离心纯化，即得调控性CIAPim基因重组腺病毒Ad-SurvivinP-CIAPINl。进一步，步骤a中所述引物序列为上游引物5，-gcctcgaggctcaagtgacaagcaagt gtttat-3，；下游弓丨物5，-gcccatgggggctcacctggctgctc-3，。进一步，步骤a中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性1 分钟、58°C退火1分钟，72°C延伸1. 5分钟，共30个循环，最后72°C延伸7分钟。进一步，步骤b中所述引物序列为上游引物5，-gggaagcttatggcagattttgggatc t_3，；弓L 5' -atgggatccctagtacgcagtaagcggtc-3‘ 进一步，步骤b中所述PCR循环条件参数为94°C预变性3分钟，然后94°C变性30 秒、65 °C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，共30个循环，最后72°C延伸10分钟。3、调控性CIAPim基因重组腺病毒在制备神经胶质瘤治疗药物中的应用。本专利技术的有益效果在于本专利技术的调控性CIAPim基因重组腺病毒具有较强的选择性和特异性，通过肿瘤特异性Survivin启动子调控CIAPim基因的表达，能够使CIAPIN1 基因选择性地表达于神经胶质瘤细胞中，发挥抑制细胞克隆、诱导细胞凋亡的作用，在准确杀伤神经胶质瘤细胞的同时减少正常组织细胞的损伤，体内实验显示其能够有效抑制神经胶质瘤细胞的生长，延长荷瘤裸鼠的平均生存期并提高平均生存率，因此，可用于制备神经胶质瘤治疗药物，在神经胶质瘤基因治疗领域有着较好的开发应用前景。附图说明图1为Survivin启动子PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，1为PCR产物。图2为CIAPim基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DNA分子量标准，1 为PCR产物。图3为感染本专利技术重组腺病毒的神经胶质瘤细胞和正常组织细胞的凋亡率比较图。图4为感染本专利技术重组腺病毒的神经胶质瘤细胞和正常组织细胞的克隆形成率比较图。图5为给予本专利技术重组腺病毒或PBS的荷瘤裸本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．调控性ＣＩＡＰＩＮ１基因重组腺病毒，其特征在于：将一个ＣＩＡＰＩＮ１基因表达盒插入复制缺陷５型腺病毒基因组中而得到，所述ＣＩＡＰＩＮ１基因表达盒由Ｓｕｒｖｉｖｉｎ启动子、ＣＩＡＰＩＮ１基因和终止子组成，所述ＣＩＡＰＩＮ１基因的表达受Ｓｕｒｖｉｖｉｎ启动子调控。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨曌，吴玉章，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：85
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