本发明专利技术涉及生物医药工程技术领域。本发明专利技术筛选并通过基因突变的方法获得一株高转导效率、高肝细胞嗜性的丙型肝炎病毒包膜蛋白基因，将该基因的表达质粒与基于HIV的慢病毒包装质粒共转染可获得感染性滴度达到1×107FFU/ml的丙型肝炎病毒拟似病毒，该方法获得丙型肝炎病毒拟似病毒的感染滴度比其他方法高100倍，由于丙型肝炎病毒拟似病毒为肝细胞特异性感染，因此除了用于研究丙型肝炎的感染机制、评价中和抗体、筛选小分子药物以外，还可能作为肝细胞靶向性基因治疗载体，具有重要的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药工程
，是一种含高转导效率、高肝细胞嗜性丙型肝炎包膜蛋白的拟似病毒颗粒及其制备方法。
技术介绍
丙型肝炎病毒Q^patitis C virus, HCV)是一种嗜肝单股正链RNA病毒，属于黄病毒属成员，该病毒嗜肝特性的机制目前尚不十分清楚。目前鉴定出人四次跨膜素家族成员⑶81、清道夫受体SR-BI和紧密连接蛋白claudin 1、occludin是HCV感染必须依赖的受体，但这四种分子也同时表达于其他组织细胞，因此不能以此完美解释HCV的嗜肝特性。 HCV的体外细胞培养非常困难，目前尚不能用感染者血清在体外感染靶细胞从而达到分离培养的目的，这给研究HCV带来了很大困难。2003年法国和美国的两个实验室分别报道，用编码小鼠白血病病毒(MMLV)或人类免疫缺陷病毒(HIV)包装信号RNA序列及报告基因序列的质粒与衣壳蛋白-逆转录酶表达质粒以及HCV包膜蛋白表达质粒共转染人胚胎肾成纤维细胞，可以获得可感染性与HCV相似的嵌合病毒，该病毒表面的双层脂质膜中镶嵌有生物活性的HCV包膜糖蛋白，内部含有MLV或HIV的衣壳蛋白-逆转录酶。嵌合病毒表面的HCV包膜蛋白是该嵌合病毒具有与HCV相似生物特性(肝细胞嗜性、能被HCV中和抗体中和等)的结构基础。由于该嵌合病毒能模拟HCV的感染，但内部并非HCV的结构，因此被称为 HCV 拟似病毒(HCV pseudo-particle, HCVpp)。大量研究显示，HCVpp的细胞嗜性与天然HCV完全一致，只能感染人类肝组织来源的某些细胞系，感染性也严格依赖四种受体的表达，HCV包膜蛋白中和抗体能有效中和 HCVpp的感染性。HCVpp的这些特点使其成为研究HCV感染机制的重要模型，同时，也为开发靶向感染肝细胞的病毒载体提供了一种有效途径。然而，目前所有实验室建立的HCVpp 制备方法均存在一个共同的问题，就是病毒产量及转导效率很低，293T细胞培养上清中的病毒滴度均低于105FFU(fOcus forming unit)/ml，这在很大程度上限制了 HCVpp的应用， 因此高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性的丙型肝炎拟似病毒颗粒的研制在HCV研究及生物技术运用上意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种能制备高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性HCVpp的方法，高滴度、高转导效率、高肝细胞嗜性的HCVpp不仅可用于研究HCV的感染机制，评价 HCV疫苗诱导抗体的保护作用，还能用作肝组织靶向感染的基因治疗载体。HCV拟似病毒颗粒的主要包括三个基本成分1)慢病毒/逆转录病毒衣壳蛋白-逆转录酶，在细胞浆中主要负责识别并结合病毒核酸、构成病毒样结构及分泌出牙新的病毒颗粒，是病毒滴度的主要决定元件；在感染靶细胞后，该蛋白元件负责将病毒核酸RNA变成双链DNA，在其它蛋白的参与下将该DNA插入到核内染色体中完成病毒核酸插入宿主染色体以达到复制繁殖的目的。幻报告基因，是将报告基因绿色荧光蛋白/荧光素酶等编码序列与衣壳蛋白-逆转录酶识别序列合理拼接起来的一段RNA，在拟似病毒感染靶细胞后，该RNA能按照逆转录病毒/慢病毒在感染细胞内部的生活史，完成从RNA变成双链DNA的过程，并插入宿主染色体内，依靠宿主信使RNA的生理代谢特点，完成报告基因的表达，从而为人工制作的拟似病毒提供方便可靠的评测手段。幻HCV包膜蛋白，该蛋白元件在拟似病毒颗粒中的主要职能是负责模拟相关病毒的靶细胞嗜性，能很好地代表病毒感染早期阶段病毒包膜蛋白与宿主细胞发生的一切生物学现象。大量研究显示，含艾滋病毒包膜蛋白的拟似病毒颗粒能很好的呈现艾滋病毒包膜蛋白的生物学特性，含流感病毒包膜蛋白的拟似病毒颗粒也能很好地代表流感病毒感染早期包膜蛋白的生物学特性。HCV包膜蛋白能有效、高靶向地将HCVpp导入某些肝癌细胞株或者原代肝细胞、该特性能有效地被HCV 感染病人血清中和说明该包膜蛋白能很好地代表HCV感染特性，是区别不同拟似病毒颗粒的最关键元件。HCV主要分成1-6个主要基因型别，近百种基因亚型，每种型别具备不同的生物学特性，如1型占世界流行株的一半以上，也是干扰素加利巴韦林治疗不敏感的一个基因型。这些特性暗示着这个型别的HCV在宿主和病毒漫长的自然选择中具备比较强的生存能力。拟似病毒技术出现之前，人们没有办法来研究各个型别HCV包膜蛋白的生物学特性的差异，如，感染能力等，因此，研究不同基因型别HCV包膜蛋白的感染能力，筛选出具备高感染力的HCV包膜蛋白意义重大。本专利技术主要体现在筛选、优化了一株HCV包膜蛋白全长基因(lb亚型)，含有该序列编码的包膜蛋白的拟似病毒感染滴度可达到107FFU/ml。具体内容如下一，HCV包膜蛋白全长基因的克隆从50名HCV RNA阳性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，然后用逆转录和聚合酶链反应扩增出HCV包膜蛋白全长基因，将扩增的基因插入高效表达载体，然后对扩增的基因进行测序鉴定。二，功能性HCV包膜蛋白编码序列的筛选运用50株HCV包膜蛋白全长基因插入表达质粒，结合衣壳蛋白-逆转录酶、报告基因表达系统，共同转染细胞，分别制作成50种HCVpp，50种HCVpp同时分别感染人肝癌Huh7细胞，72小时后用流式细胞仪检测Huh7细胞内报告基因绿色荧光蛋白(慢病毒质粒表达)的表达，以此判断50种HCVpp将报告基因转导到靶细胞的效率。通过该实验筛选出一株可制备出5X105FFU/ml HCVpp的HCV包膜蛋白编码基因。三、HCV包膜蛋白基因的优化HCV包膜蛋白E2氨基末端的27个氨基酸高度变异，被成为高变区 1 (hypervariable region 1，HVR1)，HVRl 是介导 HCV 包膜蛋白与 HCV 受体 SR-BI 结合的关键功能肽段，该肽段序列的变异不仅可使得HCV逃避免疫应答，还能通过调节HCV包膜蛋白与SR-BI的亲和力而影响HCV的感染性。我们将HVRl的第8和第12位氨基酸残基同时突变为组氨酸，并缺失第16 M位氨基酸残基，构成优化的HCV包膜蛋白表达序列，运用该序列编码的HCV包膜蛋白构建新的HCVpp，比较该拟似病毒与未优化的拟似病毒基因转导效率，结果显示该HCVpp感染性滴度能达到1 X 107FFU/mlo四，HCVpp细胞嗜性的鉴定我们进一步将HCVpp感染9种细胞系，结果表明，HCVpp仅能感染人肝组织来源的 Huh7细胞和HepIBB细胞系。集合国际同行的结果，含该包膜蛋白显示很好的肝细胞嗜性。本专利技术中用于制备HCVpp的HCV包膜蛋白基因序列如SEQ ID NO. 1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。附图说明图1 :50株HCVpp的感染性检测图2 =HVRl突变对HCVpp感染性的影响图3 =HCVpp对不同细胞系的易感性具体实施例方式实施例1 :HCV包膜蛋白全长基因的克隆1、HCV核酸的抽提分别从50名HCV RNA阳性感染者血清中抽提病毒核酸RNA，采用QIAGEN公司 QIAamp Ultraseus virus 试齐[|盒。具体方法取Iml血清至2ml EP管并平衡温度至15°C _25°C，加800ul Buffer AC, 加5. 6ulcarrier RNA到EP管盖子里，然后漩涡振本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种高滴度特异性感染肝细胞的丙型肝炎拟似病毒的制备方法，其特征在可获得感染性达到１×１０７ＦＦＵ／ｍｌ的丙型肝炎拟似病毒。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王岳，谭文杰，赵平，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：11
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