【技术实现步骤摘要】
本专利技术针对人肠道病毒a组设计出一对特异性引物，能够快速、准确地同步检测包括25个血清型的人肠道病毒a组病毒，即ev-a71,ev-a76,ev-a89～92，ev-a144,ev-a119～121,cva2～8,cva10,cva12,cva14,cva16。同时结合本专利技术公开的肠道病毒a组血清型分型方法可以确定未知的人肠道病毒a组病毒的血清型别，对人肠道病毒a组血清型鉴定具有特异性较强且灵敏度较高的特点。现有技术中，关于人肠道病毒a组血清型的鉴定主要分为两大类，一类是传统的血清中和试验进行血清型别鉴定，另一类是通过分子生物学方法进行血清型的鉴定，并通过序列比对分析遗传特征。传统方法根据肠道病毒的抗原性，制备可能的新型病毒抗血清，与已知血清型标准株及其抗血清进行相互间交叉中和试验以确定新血清型病毒。但该方法耗时较久，无法应对突发公共卫生事件。另一类分子生物学鉴定方法中，现在已有的鉴定人肠道病毒a组血清型的分子生物学方法需要多对引物或者多次流程，过程繁琐。本专利技术只采用一对引物，通过一步式pcr即可实现对多个肠道病毒a组血清型的鉴定。而且本专利技术的引物基于vp1区设计，基于vp1区进行人肠道病毒a组血清型鉴定在特异性和灵敏度上优于现有的采用vp4/vp2和5'-非翻译区对肠道病毒a组血清型的鉴定。综上，我们的针对人肠道病毒a组的血清型鉴定引物在对人肠道病毒a组进行鉴定时更加省时省力，特异性强，灵敏度高。
技术介绍
技术实现思路
1、本专利技术提供了一对用于人类肠道病毒a组血清鉴定的特
2、evay17：5’-tggtciggitciytirarrtiacittyatgt-3’，31bp，纯化方式：page
3、(序列1)
4、evaz17：5’-tcccaiaciarrttigcccartc-3’，23bp，纯化方式：page
5、(序列2)
6、引物位于人类肠道病毒的vp1核苷酸编码区。
7、(a：腺嘌呤，c：胞嘧啶，g:鸟嘌呤，t:胸腺嘧啶，i：次黄嘌呤，r：简并碱基腺嘌呤和鸟嘌呤，y：简并碱基胞嘧啶和胸腺嘧啶)
8、在序列表中将i替换为n。
9、本专利技术所述引物为人工合成，可以采用任意一种现有技术制备，如：
10、目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成dna片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将dna固定在固相载体上完成dna链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’→5’磷酸二酯键连接。引物合成特点：合成的纯度高，合成的序列长以及合成的效果好。
11、合成过程：
12、第一步是将预先连接在固相载体上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团dmt，获得游离的5′-羟基。
13、第二步，合成dna的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被dmt保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应；
14、第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5′-羟基没有参加反应(少于2％)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在后续环节根据实验需要来选择纯化方式分离掉。
15、第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
16、经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5′-羟基上的保护基团dmt，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察tca处理阶段的颜色判定合成效率。通过氨水高温处理，连接在cpg上的引物被切下来，通过opc,page等手段纯化引物，成品引物用c18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定od260定量，根据定单要求分装。
17、本专利技术的另一个目的在于提供一种用于人肠道病毒a组血清型分型的试剂盒，包含所述引物。
18、本专利技术所述的试剂盒，还包括以下成分：2×reaction mix缓冲液，rna free h2o，rt/platinum taq mix酶，模板rna。
19、优选的，本专利技术所述的试剂盒，包括以下成分：
20、
21、本专利技术的另一个目的在于提供对人肠道病毒a组血清型分型的检测方法，所述方法，步骤如下：
22、(1)核酸提取；
23、(2)pcr扩增vp1核苷酸序列；
24、(3)琼脂糖凝胶电泳；
25、(4)纯化pcr dna扩增片段；
26、(5)测序；
27、(6)纯化序列反应；
28、(7)在abi自动测序仪上分析纯化的序列反应；
29、(8)序列整理及血清型别比对。
30、优选的，本专利技术所述的检测方法，包括以下步骤：
31、1、核酸提取：
32、试剂盒：rneasy mini kit试剂盒(qiagen，德国)
33、(1)第一次使用试剂盒时，需进行试剂的配制：在aw1和aw2缓冲液中按照试剂瓶上提示体积加入无水乙醇稀释；在装有310ug carrier rna干粉瓶中加入310ulave缓冲液，震荡混匀，瞬时离心。将310ul上述混合液加入avl(31ml)配成avl工作液，混匀备用，所有试剂配制完毕后在瓶盖进行标记并注明配制日期；
34、(2)取1.5ml离心管，加入560ulavl工作液和140ul样本，振荡混匀15s，室温放置10min；
35、(3)瞬时离心后，加入560ul无水乙醇，振荡混匀15s，再次瞬时离心；
36、(4)吸取630ul混合液至分离柱中，8000rpm离心1min，更换收集管；
37、(5)重复步骤4；
38、(6)在分离柱中加入500ulaw1缓冲液，8000rpm离心1min，更换收集管；
39、(7)在分离柱中加入500ulaw2缓冲液，14000rpm离心3min，更换收集管；14000rpm再次全速离心1min；
40、(8)将分离柱放入新的1.5ml离心管中，加入50ulavebuffer，室温放置1分钟，随后8000rpm离心1min，弃分离柱，获得病毒总rna，置于4℃冰箱或冰上待用，或放入﹣70℃冰箱长期保存。
41、2、pcr扩增vp1核苷酸序列
42、使用本专利技术设计的evay17/evaz17引物和pcr试剂盒进行扩增测序。
43、肠道病毒引物：
44、evay17：5’-tggtciggitciytirarrtiacittyatgt-3’
45、evaz17：5’-tcccaiaciarrttigccc本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.人肠道病毒A组血清型分型引物，引物的序列如下：
2.一种用于人肠道病毒A组血清型分型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：2×Reaction Mix缓冲液，RNA free H2O，RT/Platinum Taq Mix酶，模板RNA。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
5.一种同步检测人肠道病毒A组病毒25个血清型别分型的方法，所述方法，包括使用权利要求1所述引物的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，包括使用权利要求2-4任一所述试剂盒的步骤。
7.根据权利要求5所述的方法，包括以下步骤：
8.根据权利要求5所述的方法，包括以下步骤：
9.根据权利要求5所述的方法，所述人肠道病毒A组病毒25个血清型别为EV-A71,EV-A76,EV-A89～92，EV-A144,EV-A119～121,CVA2～8,CVA10,CVA12,CVA14,CVA16。
10.权利要求2所
...【技术特征摘要】
1.人肠道病毒a组血清型分型引物，引物的序列如下：
2.一种用于人肠道病毒a组血清型分型的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，还包括以下成分：2×reaction mix缓冲液，rna free h2o，rt/platinum taq mix酶，模板rna。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，包括以下成分：
5.一种同步检测人肠道病毒a组病毒25个血清型别分型的方法，所述方法，包括使用权利要求1所述引物的步骤。
<...【专利技术属性】
技术研发人员：张勇，孙强，严冬梅，肖金波，祝双利，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。