一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用技术
【技术实现步骤摘要】
一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用
本专利技术属于生物
和遗传工程领域
，尤其涉及一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。
技术介绍
细菌能够分泌自诱导因子感知周围环境中细菌的密度并调控基因表达的现象称为群体感应(quorumsensing，QS)，参与调控细菌的多种生长发育过程，如生物发光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、细菌毒力因子分泌等、与人类卫生保健、农业生产及环境保护等都有密切的关系。根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS系统主要分为3种：革兰阴性菌的AHL-LuxI/LuxR系统、革兰阳性菌中寡肽介导的双组分感应系统与呋喃硼酸二脂类化合物(AI-2)介导的AI-2/LuxS种间群体感应系统。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在种间存在广泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群体感应调控系统备受重视。研究其诱导的密度感应机制，有助于理解微生物生物学行为，并为探索治疗微生物感染提供新思路。细菌通过种间群体感应通用信号分子AI-2实现种间信息交流，而S-核糖基高半...
【技术保护点】
一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28‑a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28‑a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28‑a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a‑luxS。
【技术特征摘要】
1.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28-a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a-luxS。2.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述LuxS基因来源于植物源乳酸菌。3.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述LuxS基因PCR扩增时的引物如下：前引物luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’；后引物luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’。4.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5～7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗义勇，宋晓东，柳陈坚，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
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