本发明专利技术公开了一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及表达方法和应用，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶Hind Ⅲ和Xho Ⅰ分别对pET28‑a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有Hind Ⅲ和Xho Ⅰ粘性末端的luxS基因片段和pET28‑a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和载体片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a‑luxS。本发明专利技术获得的蛋白质在细菌交流介导的有益性状开发和有害性状控制的研究及应用领域具有巨大潜力。
【技术实现步骤摘要】
一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用
本专利技术属于生物
和遗传工程领域
，尤其涉及一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。
技术介绍
细菌能够分泌自诱导因子感知周围环境中细菌的密度并调控基因表达的现象称为群体感应(quorumsensing，QS)，参与调控细菌的多种生长发育过程，如生物发光、孢子形成、抗生素生成、生物薄膜形成、细菌毒力因子分泌等、与人类卫生保健、农业生产及环境保护等都有密切的关系。根据细菌合成的信号分子和感应机制不同，QS系统主要分为3种：革兰阴性菌的AHL-LuxI/LuxR系统、革兰阳性菌中寡肽介导的双组分感应系统与呋喃硼酸二脂类化合物(AI-2)介导的AI-2/LuxS种间群体感应系统。由于在自然状态下微生物多以不同菌种混合存在的方式生存，并在种间存在广泛的信息交流，所以AI-2/LuxS群体感应调控系统备受重视。研究其诱导的密度感应机制，有助于理解微生物生物学行为，并为探索治疗微生物感染提供新思路。细菌通过种间群体感应通用信号分子AI-2实现种间信息交流，而S-核糖基高半胱氨酸裂解酶(LuxS)是AI-2合成途径中的关键酶。AI-2合成途径中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)被作为一种甲基供体,产生的毒性中间产物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)由5-甲硫腺苷/S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(Pfs)水解成S-核糖高半胱氨酸(SRH)和腺嘌呤。LuxS催化SRH裂解成DPD和高半胱氨酸，DPD自动进行分子重排生成信号分子AI-2。乳酸菌是革兰氏阳性细菌，其中不仅有寡肽介导的双组分感应系统，而且存在AI-2/LuxS群体感应系统。乳酸菌产细菌素与对人体消化道粘附的特性有助于抑制或排挤机会致病菌，降低人体被致病菌感染的风险。研究表明乳酸菌的这些益生特性受QS系统调控。目前市面缺少商品化的AI-2，但存在SAH。SRH可在酸性高温条件下水解，生成SRH，再经LuxS体外催化合成DPD。对于研究AI-2介导的群体感应系统的实验来说，有在体外高效的表达LuxS蛋白，继而体外合成AI-2用于考察不同实验组别的差异，能使实验结果更具有说服力。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体及其表达方法和应用。本专利技术将S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因(luxS)的重组表达载体pET28a-luxS，将该表达载体导入大肠杆菌细胞内，通过诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的诱导，完成S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达，并通过亲和纯化得到目的蛋白。本专利技术第一方面，提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28-a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a-luxS。所述LuxS基因来源于植物乳杆菌。植物乳杆菌是公认的益生菌，在食品发酵行业中已经被广泛应用，所以来自于其中的基因也可认为是对人体安全无害的，这将为该专利技术将来在食品发酵领域的应用提供理论的安全保障。所述LuxS基因PCR扩增时的引物如下：前引物luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’；后引物luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’；本专利技术第二方面，提供一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5～7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶；所述缓冲液Ⅰ为50mMNaH2PO4，500mMNaCl，90～110mMimidazole(咪唑)，pH7.5～8.5；所述缓冲液Ⅱ为50mMNaH2PO4，500mMNaCl，140～160mMimidazole，pH7.5～8.5；所述缓冲液Ⅲ为50mMNaH2PO4，500mMNaCl，190～210mMimidazole，pH7.5～8.5；所述缓冲液Ⅳ为50mMNaH2PO4，500mMNaCl，250～290mMimidazole，pH7.5～8.5。250mMimidazole(咪唑)浓度的洗脱液可正好洗脱目的蛋白，而较低的浓度梯度可以有效清除杂蛋白，保留目的蛋白。作为优选，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤具体操作如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素45～55μg/ml的LB液体培养基中，将培养物按照0.8～1.2％接种量接种于500mL含有卡拉霉素45～55μg/ml的LB培养基，36～38℃振荡培养，至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG至0.8～1.2mM，36～38℃继续培养6～8h；4000～6000rpm离心5～7min，收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；所述非变性镍柱结合缓冲液成分如下：50mMNaH2PO4，500mMNaCl，20～50mMimidazole，pH7.5～8.5。作为优选，所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化中缓冲液Ⅰ洗脱9～11个柱体积，缓冲液Ⅱ洗脱9～11个柱体积，缓冲液Ⅲ洗脱4～6个柱体积，缓冲液Ⅳ洗脱18～22个柱体积。所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在Al3+、Ca2+和EDTA影响下活性上升，在Cu2+、Ni2+、Zn2+及甘油作用下活性下降，即S-核糖基高半胱氨酸裂解酶参与催化反应时Al3+、Ca2+和EDTA能够增强催化效率，Cu2+、Ni2+、Zn2+及甘油降低催化效率。本专利技术第三方面，还提供所述制备方法制得的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶在合成AI-2及其AI-2类似物方面中的应用。本专利技术特点之一在于，本专利技术使用的luxS基因来源于乳酸菌，植物乳杆菌是公认的益生菌，在食品发酵行业中已经被广泛应用，所以来自于其中的基因也可认为是对人体安全无害的，这将为该专利技术将来本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种S‑核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28‑a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28‑a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28‑a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a‑luxS。
【技术特征摘要】
1.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述基因重组表达载体通过以下方法得到：限制性内切酶HindⅢ和XhoⅠ分别对pET28-a载体和PCR扩增出的LuxS基因纯化产物进行同步酶切，分别获得带有HindⅢ和XhoⅠ粘性末端的luxS基因片段和pET28-a载体大片段，采用琼脂糖凝胶电泳后分别进行回收后，luxS基因片段和pET28-a载体大片段进行连接，得到连接产物，连接产物导入到大肠杆菌BL21感受态细胞中，大肠杆菌BL21中含有基因重组表达载体pET28a-luxS。2.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述LuxS基因来源于植物源乳酸菌。3.如权利要求1所述的S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体，其特征在于，所述LuxS基因PCR扩增时的引物如下：前引物luxS-F：5’-CGAAGCTTTGGCTAAAGTAGAAAGTT-3’；后引物luxS-R：5’-ATTCTCGAGCTATTCAACGACTTTGCG-3’。4.一种S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括构建S-核糖基高半胱氨酸裂解酶基因重组表达载体的步骤，S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤和S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的表达步骤如下：挑取含有基因重组表达载体pET28a-luxS的大肠杆菌单菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，培养至培养物的OD600值达到0.6-0.8，向培养物中加入IPTG，继续培养5～7h，离心收集菌体，用非变性镍柱结合缓冲液重悬菌体，超声波破碎后离心，得到S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白；所述S-核糖基高半胱氨酸裂解酶的纯化步骤如下：S-核糖基高半胱氨酸裂解酶粗蛋白采用镍亲和层析柱进行纯化，先用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅰ洗脱，然后采用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅱ洗脱，再用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅲ洗脱，去除非特异性结合的杂蛋白；最后用非变性镍柱洗脱缓冲液Ⅳ，收集洗脱液，SDS-PAGE检测洗脱液中样品纯度，得到纯化后的S-核糖...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗义勇，宋晓东，柳陈坚，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南,53
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。