一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用。该成套载体分为单基因表达载体和共表达接收载体两部分，蛋白复合物各组分可并行克隆到不同的单基因表达载体中，然后将单基因表达载体和共表达载体在同一管中进行组装反应，即可得到蛋白复合物共表达载体。通过试验证明：本发明专利技术通过IIs型限制性内切酶的设计，可使酶切和连接在同一管中进行，中间不需要酶切产物纯化等操纵，同时，本发明专利技术的设计可以将多个蛋白的转录单元一次实验同时组装到共表达载体上，因此共表达载体的组装极大地缩短了克隆时间，而且不同抗性以及ccdB筛选，提高了克隆的效率，另外，共表达载体转录出单顺反子mRNA，可提高蛋白表达量。

【技术实现步骤摘要】
一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于多元蛋白复合物表达的成套载体及其应用。
技术介绍
相比于单一的蛋白组分，科学家们将目光逐渐转移到了结构和功能更难研究但也更为重要的多元蛋白复合物上。多元蛋白复合物在许多生物过程中都是重要的调控元件，除此之外，一些蛋白只有作为复合物的组分时才具有活性。因此，如果能直接研究复合物的结构和功能，那么很多生物学问题就能得到更直观的解释。表达和纯化蛋白复合物是结构研究的必要环节。大肠杆菌至今依然是最常用的表达重组蛋白的宿主。首先，利用大肠杆菌，可以用很短的时间和很少的成本获得大量的蛋白；第二，无论是从基因克隆还是蛋白纯化方面，大肠杆菌表达体系都已经非常成熟，便于进行多种条件的选择和检测；第三，作为原核生物，大肠杆菌缺少一些翻译后修饰，这有时更有利于研究。目前利用大肠杆菌表达体系获得蛋白复合物有以下几种途径：第一，将蛋白复合物各组分单独纯化出来(有些组分的纯化可能还涉及变性和复性过程)，在体外重组复合物；第二，在体内共表达复合物。在第一种方法中，复合物中某组分在单独表达的时候可能不可溶，同时体外组装也可能形成错误的复合物。然而，如果将复合物在体内实现共表达，可有利于每一蛋白的正确折叠，以及复合物各组分之间正确的互作，更有可能形成可溶的复合物。综上所述，大肠杆菌体内共表达系统在研究蛋白复合物过程中具有巨大的优势。共表达可以通过单个或多个载体实现。在单基因载体共表达方法中，每个载体携带一个基因。在使用多个载体时，每个载体都需要带有不同的选择标记、相互兼容的复制子和相似的拷贝数。然而，大肠杆菌的标记通常为抗生素，在培养时添加多种抗生素会影响细菌的生长速率。而且上述严格的要求也为选择多载体增加了难度。相比于单基因载体，多基因载体可将数个基因克隆到单个载体上进行共表达。通常情况下，这种载体需要更复杂的多克隆位点，利用不同组限制性内切酶实现每一步的克隆。在基因的转录方面，几个基因可以位于同一个启动子下，得到的mRNA是多顺反子；如果每个基因都单独的启动子控制，那么得到的mRNA是单顺反子。一些研究报道，多顺反子表达载体会导致不同蛋白表达量不一致，靠近启动子的蛋白表达量高于下游蛋白，这样会影响复合物不同组分的得量。在单顺反子表达载体中，每个蛋白都由单独的启动子控制，可以掌控表达水平，从而获得表达量更高的蛋白。这类的载体有：Novagen的pETDuet系列，pET-MCP系列以及pQLink系列等。这些表达载体需要多种限制性内切酶位点，为克隆增加了难度。此外，目前这些载体基本上都是以串联的方式将各蛋白逐个依次连入，因此随着复合物中所需组分数目的增加，共表达载体的构建时间需要不断的延长。所以，构建一种可将复合物中各组分进行并联拼接的、具有多重转录单元的共表达载体是当前的迫切需求。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用于多元蛋白复合物表达的成套产品。本专利技术提供的用于多元蛋白复合物表达的成套产品由m个核心片段和共表达载体组成；所述m为大于等于1的整数；所述m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；所述核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端1y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；所述核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端2y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；依次类推，所述核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；所述共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；所述共表达载体的核心片段A从5’端起依次包括粘性末端Ax、单碱基N、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、筛选标记基因、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和所述骨架载体下游黏性末端不同且不匹配；所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和所述核心片段A3经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；依次类推；所述核心片段Am-1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端(m-1)y和所述核心片段Am经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和所述核心片段Am经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配。上述成套产品中，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、蛋白纯化标签、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子。上述成套产品中，每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶2酶切产生的筛选标记基因上游黏性末端和所述筛选标记基因下游黏性末端不同且不匹配；每个所述IIs型限制性内切酶酶切产生的粘性末端内部均不能形成回文结构；所述核心片段除描述的位置外，其他部分不含所述IIs型限制性内切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于多元蛋白复合物表达的成套产品，由m个核心片段和共表达载体组成；所述m为大于等于1的整数；所述m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；所述核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端1y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；所述核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端2y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；依次类推，所述核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；所述共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；所述共表达载体的核心片段A从5’端起依次包括粘性末端Ax、单碱基N、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、筛选标记基因、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和所述骨架载体下游黏性末端不同且不匹配；所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和所述核心片段A3经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；依次类推；所述核心片段A m‑1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端(m‑1)y和所述核心片段Am经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和所述核心片段A m经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配。...

【技术特征摘要】
1.一种用于多元蛋白复合物表达的成套产品，由m个核心片段和共表达载体组成；所述m为大于等于1的整数；所述m个核心片段按照阿拉伯数字顺次命名为核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；所述核心片段A1从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端1x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端1y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；所述核心片段A2从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N、粘性末端2x、用于构建外源基因表达盒的DNA片段和粘性末端2y、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；依次类推，所述核心片段Am从5’端起依次包括IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N粘性末端mx、用于构建外源基因表达盒的DNA片段、粘性末端my、单碱基N和所述IIs型限制性内切酶1的识别序列；每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的用于构建外源基因表达盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；所述共表达载体由核心片段A和骨架载体组成；所述共表达载体的核心片段A从5’端起依次包括粘性末端Ax、单碱基N、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、筛选标记基因、所述IIs型限制性内切酶1的识别序列、单碱基N和粘性末端Ay；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的骨架载体上游黏性末端和所述骨架载体下游黏性末端不同且不匹配；所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1y和所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2x匹配；所述核心片段A2经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端2y和所述核心片段A3经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端3x匹配；依次类推；所述核心片段Am-1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端(m-1)y和所述核心片段Am经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端mx匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ax和所述核心片段A1经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端1x匹配；所述共表达载体经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端Ay和所述核心片段Am经过所述IIs型限制性内切酶1酶切产生的粘性末端my匹配。2.根据权利要求1所述的成套产品，其特征在于：所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子；或，所述用于构建外源基因表达盒的DNA片段从5’端起依次包括驱动外源基因表达的启动子、乳糖操纵子、核糖体结合位点、蛋白纯化标签、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端、单碱基N、IIs型限制性内切酶2的识别序列、筛选标记基因、所述限制性内切酶2的识别序列、单碱基N、IIs型限制性内切酶2产生的粘性末端和终止所述外源基因表达的终止子。3.根据权利要求1或2所述的成套产品，其特征在于：每个所述核心片段经过所述IIs型限制性内切酶2酶切产生的筛选标记基因上游黏性末端和所述筛选标记基因下游黏性末端不同且不匹配；每个所述IIs型限制性内切酶酶切产生的粘性末端内部均不能形成回文结构；所述单碱基N为A、G、C和T中的任意一种。4.根据权利要求1-3中任一所述的成套产品，其特征在于：所述IIs型限制性内切酶1为BsmBI；所述IIs型限制性内切酶2为BsaI；所述筛选标记基因为ccdB基因。5.根据权利要求1‐4中任一所...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴俊彪，陈柱成，吴庆余，秦怡然，林继伟，
申请(专利权)人：清华大学，无锡青兰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11