本发明专利技术涉及植物病毒学和分子生物学，提供了一个烟草丛顶病毒(TBTV)RdRp蛋白的原核表达载体。该质粒载体名称为pMAL‑TB‑RdRp，含有TBTV中国分离物的RdRp编码序列。该质粒作为TBTV RdRp蛋白的原核表达载体，其原核表达产物通过亲和层析纯化可获得有活性的RdRp蛋白，建立RdRp介导的体外复制研究体系，此体外复制体系将来可用于TBTV复制调控的研究。
【技术实现步骤摘要】
一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体
本专利技术涉及植物病毒学和分子生物学，提供了一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体。
技术介绍
烟草丛顶病(tobaccobushytopdisease)于1958年在非洲津巴布韦首次报道，后陆续在其邻国，以及亚洲的巴基斯坦、泰国发现。90年代，在云南保山、三江流域爆发流行，在部分烟区造成毁灭性灾害。目前，该病在大理、保山和玉溪等主要烟区零星发生。感病烟株叶色淡绿或黄化，并伴有系统坏死枯斑或坏死线纹，苗期感病烟株严重矮化、缩顶，叶片变小，而晚期感病的烟株腋芽过度增生，株型成为密生小叶、小枝的丛枝状塔型。烟草丛顶病通常由番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)幽影病毒属(Umbravirus)成员烟草丛顶病毒(Tobaccobushytopvirus,TBTV)及黄症病毒科(Luteoviridae)的烟草扭脉病毒(Tobaccoveindistortingvirus,TVDV)复合侵染引起。自然条件下，烟草丛顶病主要由蚜虫传播；发病烟苗的汁液摩擦接种健康烟苗也可致病，但造成TVDV的丢失，且不能被蚜虫传播；表明TVDV不能通过机械接种传播，TBTV单独接种烟苗即可发病。莫笑晗等于2003年报道了TBTV中国分离物的基因组全序列。TBTV的基因组是一条(+)ssRNA，由4152个核苷酸组成。其基因组编码4个蛋白，其中ORF1和ORF2的编码框重叠存在，表达产物是病毒的复制酶(RdRp)组分，ORF3蛋白可能参与病毒的长距离运输，ORF4蛋白可能是病毒细胞间运动的功能蛋白。与其他幽影病毒属成员相似，TBTV5’端非编码区很短(10nt)，ORF1编码35kD的蛋白，ORF2则编码98kD的蛋白，是ORF1通过-1位的移码翻译机制表达产生，其N端与ORF1蛋白序列相同，ORF2蛋白具备RNA依赖的RNA聚合酶(RNAdependentRNApolymerase，RdRp)活性。RdRp活性蛋白参与TBTV基因组的复制，直接决定TBTV在植物体内的复制水平和致病性。然而目前没有独立研究TBTVRdRp调控基因组复制的研究体系，同时由于TBTVRdRp是移码产物，植物体内表达量很低；有必要通过原核表达获得RdRp，进而建立体外复制体系进行复制调控的独立研究；但是现有技术标明具备RdRp活性的蛋白在原核表达、纯化过程中容易造成活性丧失，因而无法建立体外复制体系，因而根据现有技术是无法建立体外复制体系的。
技术实现思路
本专利技术提供了一个烟草丛顶病毒(TBTV)RdRp蛋白的原核表达载体。该质粒载体名称为pMAL-TB-RdRp，含有TBTV中国分离物的RdRp编码序列。该质粒作为TBTVRdRp蛋白的原核表达载体，原核表达产物通过亲和层析纯化可获得有活性的RdRp蛋白，建立RdRp介导的体外复制研究体系。专利技术人首先公开了一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-TB-RdRp，含有TBTV中国分离物RdRp蛋白的编码序列，其核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，氨基酸序列如SeqIDNo.2所示。该质粒载体的原核表达产物经亲和层析纯化，利用纯化后蛋白构建体外复制体系，可利用TBTV特异RNA片段为模板合成其互补链，此TBTVRdRp介导的体外复制体系，可为进一步定性定量研究TBTV基因组复制调控奠定基础。专利技术人还公开了该可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体pMAL-TB-RdRp的构建方法如下：根据TBTV中国分离物的基因组全序列(Genebank登录号：AF402620)，设计引物M-TB-ORF1-5'F和M-TB-ORF2-3'R(详细信息见表1)，分别对应于RdRp的起始密码子和终止密码子附近序列。由于TBTVRdRp是通过ORF1以-1型移码翻译机制得到表达的，因此在TBTV序列中并不存在RdRp的直接编码序列，无法通过PCR直接扩增得到RdRp编码序列。为获得TBTVRdRp编码序列，通过重叠PCR方法在TBTV全长序列的955位与956位碱基间插入一个碱基(图1所示)，形成RdRp的完整编码框。以含有TBTV中国分离物全序列的质粒pMTB1(王国鲁等，2016,植物病理学报中公开)为模板，利用引物对M-TB-ORF1-5'F/TB-936+C+956-R以及引物对TB-948+C+956-F/M-TB-ORF2-3'R在pfuTaqDNA聚合酶的作用下扩增分别得到约950bp(A段产物)和1700bp(B段产物)的PCR产物，A段和B段PCR产物经胶回收后，再利用M-TB-ORF1-5'F和M-TB-ORF2-3'R在FastPfuTaqDNA聚合酶作用下进行重叠PCR得到约2600bp的片段，此PCR产物和质粒pMAL-C2X分别经PstI和EcoRI双酶切进行连接，转化产物经菌落PCR筛选、酶切鉴定和质粒DNA测序，确认得到以pMAL-C2X为基础含TBTVRdRp蛋白编码序列的原核表达载体pMAL-TB-RdRp。表1本研究中用到的引物PrimernameSequence(5'to3')PCRfragmentSeqIDNoM-TB-ORF1-5'FGATCGAATTCATGGAGTTCATCAACAAGATAAAGCRdRpSeqIDNo.3M-TB-ORF2-3'RGATCCTGCAGTCACTAGCATTGTGTCCACAACGTCRdRpSeqIDNo.4TB-948+C+956-FATTTTTGCCTAGGGGATGTGGTCGCRdRpSeqIDNo.5TB-936+C+956-RATCCCCTAGGCAAAAATCCTTGGGCCCACRdRpSeqIDNo.6TB-T7-1-FtaatacgactcactataGAGGTTACGATATGGAGTTCTB5'160ntSeqIDNo.7TB-(144-160)-RGATCCCCGGGGCGTGACACCTCATTGGTB5'160ntSeqIDNo.8TB-T7-925-FGCtaatacgactcactataGGGCCCTTCAATGTGGGCTBint195ntSeqIDNo.9TB-1120-RGGGAGTTGTTGTGGACTCCTBint195ntSeqIDNo.10TB-T7-4003-FGCtaatacgactcactataGGCAGAAACCAAGTAGCAAATTB3'150ntSeqIDNo.11TB-4152Y-RGGGCGCGAGAGAAATB3'150ntSeqIDNo.12TBTV-210R-5'FAGGTTACGATATGGAGTTCATCAACAAGTBminus3'210ntSeqIDNo.13TBTV-210R-3'RTAGCtaatacgactcactataGGCAAGCGGTAGGTGGTBminus3'210ntSeqIDNo.14注：酶切位点用下划线表示，T7启动子序列用小写斜体表示，插入碱基用阴影表示；int：中间序列，nt：核苷酸，minus：基因组互补链获得质粒pMAL-TB-RdRp后，专利技术人利用该质粒进行原核表达，并通过亲和层析方本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL‑TB‑RdRp，含有TBTV中国分离物RdRp蛋白的编码序列，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示，氨基酸序列如Seq ID No.2所示。
【技术特征摘要】
1.一个可原核表达烟草丛顶病毒中国分离物RdRp蛋白的质粒载体，该质粒载体名称为pMAL-TB-RdRp，含有T...
【专利技术属性】
技术研发人员：原雪峰，逯晓明，于成明，王国鲁，王德亚，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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