Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法技术

本发明专利技术公开了一种Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，该方法包括如下步骤：A、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列插入表达载体质粒，并同时引入tev酶切位点；B、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：2所示核苷酸序列插入步骤A所得第一重组表达载体的多克隆位点处，测序鉴定；C、受体转染与培养：将步骤B所得第二重组表达载体转化进大肠杆菌中，当菌体长到特定程度后低温诱导培养菌体；D、目的蛋白提取：从步骤C所得菌体中提取具有高活性的Patatin样磷脂酶Ⅲ PLP3。本发明专利技术提供了一种利用原核表达系统高效可溶性表达Patatin样磷脂酶Ⅲ的方法。

【技术实现步骤摘要】
Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法
本专利技术涉及一种基因工程
，尤其是一种使用原核表达系统高效可溶性表达Patatin样磷脂酶Ⅲ的方法。
技术介绍
Patatin样磷脂酶3（Patatin-LikePhospholipase3，PLP3）是近年来在动物细胞新发现的膜结合蛋白，含有一个保守的Patatin结构域，该结构域包含Ser-Asp催化水解二元体，能非特异性的催化脂质酰基水解；人和小鼠的PLP3均为四次跨膜蛋白，能催化磷脂膜上的酰基水解，释放出游离脂肪酸（FFA）参与多种细胞内生理过程。在细胞内，PLP3与膜结合，催化磷脂酯水解，释放出FFA参与多种细胞内生理过程发挥重要作用，如参与细胞内信号传递，促进细胞凋亡。在人体内，PLP3的148M突变导致胰岛素分泌增加、肥胖、肝功能异常、肝纤维化及非酒精性脂肪肝等；在小鼠骨骼肌细胞中，PLP7保护线粒体膜心磷脂不被过氧化，参与膜和磷脂的重塑；另外，有研究证明PLP3基因的高表达与瘦肉型猪的育成显著相关。磷脂酶的活力发挥首先需要底物磷脂进入酶的结合结构域内与酶结合，底物结合导致酶的构象发生变化，暴露酶的催化活性中心才能有本文档来自技高网...

【技术保护点】
Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：A、构建第一重组表达载体：将SEQ ID NO：1所示核苷酸序列（MBP的编码基因

【技术特征摘要】
1.Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：A、构建第一重组表达载体：将SEQIDNO：1所示核苷酸序列（MBP的编码基因malE）插入表达载体质粒，并同时引入tev酶切位点；B、构建第一重组表达载体：将SEQIDNO：2所示核苷酸序列（目的基因PLP3）插入步骤A所得第一重组表达载体的多克隆位点处，测序鉴定；C、受体转染与培养：将步骤B所得第二重组表达载体转化进大肠杆菌中，当菌体长到特定程度后低温诱导培养菌体；D、目的蛋白提取：从步骤C所得菌体中提取具有高活性的Patatin样磷脂酶ⅢPLP3。2.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤A中，从大肠杆菌基因组中扩增MBP编码基因malE，上游引入Nde1、下游引入Sac1，酶切后插入pCold1中，并将6×His标签从N-端切除，融合到C-端；经PCR鉴定并提取质粒做DNA测序验证，保存pCold1-MBP质粒得到第一重组表达载体。3.根据权利要求1所述的Patatin样磷脂酶Ⅲ的可溶性表达制备方法，其特征在于：步骤B中，首先设计Patatin样磷脂酶ⅢPLP3的特异引物对，上游引入B...

【专利技术属性】
技术研发人员：李鹏鹏，王道营，张玉梅，邹烨，孙芝兰，孙冲，张牧焓，耿志明，徐为民，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32