一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b，该基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明专利技术还公开了所述基因及含有该基因的植物表达载体pCAMBIA1300‑GhNPC3b‑EPSP在提高棉花抗逆性中的应用。实验证实，本发明专利技术所述基因的表达受低磷、干旱和ABA胁迫诱导，转基因棉花实验显示可以显著提高转基因棉花的抗逆特性。预示GhNPC3b基因应用于培育抗逆转基因农作物具有极大的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b及其应用
本专利技术涉及一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b及其在提高棉花抗逆性中的应用。属于植物基因工程领域。
技术介绍
棉花是世界上最重要的天然纤维，干旱、低磷等非生物胁迫影响棉花的生长，最终导致棉花产量降低。在耕地面积只减不增的情况下，一些地方出现了粮棉争地的现象。在人类文明发展的长河中，穿衣和吃饭同等重要。解决粮棉争地的最好办法是培育抗逆性较强的优良棉花品种，及高效开发利用干旱区、盐碱地或土壤贫瘠化土地。非特异性磷脂酶C，主要以磷脂酰胆碱为底物，生成二酰甘油和磷酸胆碱。拟南芥中，非特异性磷脂酶C基因家族有6个成员(Nakamuraetal.2005)。2005年至今，相继有文献报导植物非特异性磷脂酶C参与植物激素的信号转导以及抗逆过程(Nakamuraetal.2005；Petersetal.2010；Wimalasekeraetal.2010；Kocourkovaetal.2011；Pokotyloetal.2013；Nakamura2014；Petersetal.2014；etal.2015；Pejcharetal.2015；Hongetal.2016)。然而，研究对象大多是模式生物拟南芥，其他物种中非特异性磷脂酶C的功能研究甚少。为了更好地了解植物非特异性磷脂酶C的功能，对棉花非特异性磷脂酶C基因家族进行研究是非常必要的，但检索发现迄今为止，没有任何棉花非特异性磷脂酶C的相关报导。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b及其在提高棉花抗逆性中的应用。本专利技术所述的陆地棉非特异性磷脂酶C基因，其特征在于：该基因命名为陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b，该基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。本专利技术首次克隆出陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b，实验分析证实：GhNPC3b基因定位在D13染色体上，氨基酸的数目为305，含有3个外显子，2个内含子。MEME分析发现，GhNPC3b有8个motif。对得到的motif进一步去ExPASy中分析，发现有3个motif注释为磷酸酯结构域。用NCBIConservedDomainsearch和SMART在线分析GhNPC3b的保守结构域，发现GhNPC3b含有磷酸酯结构域。对GhNPC3b进行启动子顺式作用元件分析，发现GhNPC3b的启动子中含有与胁迫相关或激素相关的顺式作用元件。如HSE(热胁迫相关)，TC-richrepeats(防御与胁迫相关)，ARE(厌氧诱导相关)，ABRE(脱落酸相关)，TGACG-motif和CGTCA-motif(茉莉酮酸甲酯相关)。对GhNPC3b进行不同器官的表达谱分析，实时荧光定量PCR结果表明，GhNPC3b主要在根中表达。对四叶期棉花分别进行低磷(5μM)、盐(200mMNaCl)、干旱(20％PEG6000)和ABA(200μM)的胁迫处理，分别在处理0，1，2，3，6，9和12h时进行取材，取材部位为根部。提取RNA并反转为cDNA，实时荧光定量PCR结果表明，低磷胁迫1h时，GhNPC3b表达水平上调，但是处理1h后表达水平下调；盐胁迫下，GhNPC3b表达水平下调；干旱胁迫处理1h和2h时表达水平分别上调5.9和3.0倍，随之表达水平表现出轻微下调的现象。ABA胁迫处理1h时，GhNPC3b表达水平上调3.4倍，处理1h后表达水平与0h相比差异不显著。GhNPC3b基因的表达受低磷、干旱和ABA的胁迫诱导。本专利技术还提供了一种含有上述陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b的植物表达载体pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。本专利技术所述陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b在提高棉花抗逆性中的应用。本专利技术所述植物表达载体pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP在提高棉花抗逆性中的应用。其中：所述抗逆性是指抗旱和/或耐低磷。所述棉花品种是春棉、夏棉、常规棉或杂交棉。在构建GhNPC3b过表达结构时，将GhNPC3b的cDNA核苷酸序列插入到植物表达载体pCAMBIA1300-EPSP中，获得质粒pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。酶切鉴定正确后，将质粒导入根瘤农杆菌AGL1或LBA4404中，用于植物遗传转化。通过农杆菌介导的转基因方法，以棉花的茎尖分生组织细胞为受体将目标基因转入棉花细胞中，即获得转基因植株。通过分子检测和植株抗逆性测定选出目的基因稳定表达且植株抗性明显提高的转基因植株。通过盆栽试验和大田抗逆性测定试验，即可筛选出抗逆性明显提高的转基因育种材料。获得的优异材料有望用于棉花育种或生产实践。本专利技术的有益效果是：本专利技术首次从陆地棉中克隆出非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b。该基因的表达受低磷、干旱和ABA胁迫诱导。同时本专利技术成功构建了pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP植物表达载体，将该植物表达载体转化到棉花中证实，本专利技术所述基因可以显著提高转基因棉花的抗逆特性。预示，GhNPC3b基因应用于培育抗逆转基因农作物具有极大的潜力。附图说明图1：质粒pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP的的结构示意图。图2：GhNPC3b基因组织特异性分析其中：TR，主根；LR，侧根；SM，茎；CL，子叶；SL，衰老叶片；EL，幼嫩叶片；ST，茎尖；BR，苞片；PE，花瓣；OV，胚珠。图3：GhNPC3b基因在非生物胁迫下的表达模式分析。具体实施方式以下叙述本专利技术的实施例。需说明的是，本专利技术的实施例只对本专利技术起说明作用而没有限制作用。如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1.高保真PCR扩增GhNPC3b目的基因取陆地棉中9807四叶期幼嫩的叶片和根，参照植物总RNA提取试剂盒(TIANGEN，北京)说明书，提取植物总RNA，用PrimeScriptRTReagentKit(TaKaRa，大连)反转录试剂盒反转录得到cDNA。以特异引物进行高保真PCR扩增。特异引物序列如下：GhNPC3b-F：GGGGTACCATGGTTTCATTAATTAATATGhNPC3b-R：CGAGCTCTCAACGATCACAAACCAAAPCR反应总体积为25μL，反应体系为：5μL5×PSBuffer，2μLdNTP，0.5μL正向引物，0.5μL反向引物，0.25μLPrimeSTARase，1μL稀释十倍的cDNA模板，ddH2O补齐至25μL。PCR扩增条件，预变性95℃3min，35个循环：98℃，10sec；56℃，5sec；72℃，90sec，最后72℃延伸6min。将PCR产物经琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收(TIANGEN，北京)纯化后，连接到pEASY-BluntCloningvector(TRANSGEN，北京)上。然后转化大肠杆菌TransT1(TRANSGEN，北京)，进行测序分析。通过上述步骤，获得了陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b的cDNA核苷酸序本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名为陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b，该基因的cDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种陆地棉非特异性磷脂酶C基因，其特征在于：所述基因命名为陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b，该基因的cDNA核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo.2所示。2.一种含有权利要求1所述陆地棉非特异性磷脂酶C基因GhNPC3b的植物表达载体pCAMBIA1300-GhNPC3b-EPSP。3.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张可炜，宋玖玲，郭志强，程成，李坤朋，张尚立，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37