一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法，该试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。其中，脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N‑羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素‑生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。与国外Diadexus公司的酶联免疫试剂盒比较，本发明专利技术制备的试剂盒大大提高了对脂蛋白相关磷脂酶A2分析的灵敏度和精密度，且操作简便、快速、更易于推广。

A rapid diagnostic kit for lipoprotein associated phospholipase A2 and methods of use

The invention relates to a rapid diagnosis of lipoprotein associated phospholipase A2 kit and use method thereof, the kit contains: the standard and quality control, liposome complexes, magnetic separation, analysis reagent buffer and cleaning liquid. The liposome complex internal coated with N hydroxysuccinimide ester terpyridyl ruthenium surface, by streptavidin biotin interaction in with lipoprotein associated phospholipase A2 antibody. Magnetic separation reagent for magnetic particles containing the amino terminal as the carrier, through the interaction of streptavidin biotin in with lipoprotein associated phospholipase A2 antibody. Compared with foreign Diadexus ELISA kit, the kit prepared by the invention greatly improves the sensitivity of lipoprotein associated phospholipase A2 analysis and precision, and the operation is simple, rapid and easy popularization.

【技术实现步骤摘要】
一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法
本专利技术属于医学生物类免疫检测试剂领域，具体涉及一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒及其使用方法。
技术介绍
脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)属于磷脂酶A2超家族，主要由成熟的巨噬细胞和T淋巴细胞合成和分泌，受炎症介质的调节。Lp-PLA2主要以与脂蛋白结合的形式存在，它既能通过水解血小板活化因子、氧化磷脂等炎症介质达到抗动脉硬化的作用，同时又具有水解氧化低密度脂蛋白中的氧化磷脂，起到促动脉粥样硬化的作用。它的双重特性，使之成为关注的热点。近年来越来越多的研究证明，Lp-PLA2是血管内皮炎症的独立危险因子，也是国际公认的一个反映心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中疾病的炎性反应标志物，与其他炎性因子比较，Lp-PLA2受其他因素的影响较小，检测具有更高的灵敏度和特异性，可作为预测心血管病、冠心病以及缺血性脑卒中事件的风险指标，用于对患者心血管疾病的早期诊断、疗效观察及预后评价。因此，检测血浆或血清中Lp-PLA2的生物活性将具有重大的临床意义和市场前景。目前，市面上测定Lp-PLA2的方法主要有：1)分光光度法、2)胶乳增强比浊法、3)放射性免疫法(RIA)、4)酶联免疫法(ELISA)。其中，1)分光光度法主要以PAF硫酯类或其类似物作为底物，Lp-PLA2将底物水解后，释放带有4-硝基苯酚基团的物质，该物质性质不稳定，马上分解成4-硝基苯酚，在405nm处可以测得由该变化引起的吸光度的改变，由此可以测定酶的活性，但该方法检测的灵敏度不高。2)胶乳增强比浊法，Lp-PLA2在磷酸盐缓冲系统中与试剂中结合有抗Lp-PLA2抗体的致敏乳胶颗粒发生抗原抗体反应，在促聚剂聚乙二醇作用下产生凝集以使浊度上升，在546nm波长检测反应液吸光度的变化，其变化程度与样本中的Lp-PLA2含量成正比，但该方法容易受血脂浓度影响产生假阳性，且不适合大批量、自动化检测。3)放射性免疫法，该方法根据竞争机制原理，125I-Lp-PLA2与抗体的结合量与标准品或样品中的Lp-PLA2的含量呈一定函数关系。用免疫分离剂将结合部分与游离部分分离后，测定结合部分的放射性强度，通过数据处理可求出样品中Lp-PLA2的浓度值，但该方法存在放射性污染的安全问题。4)酶联免疫法，此方法应用双抗体夹心法测定全血样本中人Lp-PLA2的水平。用纯化的抗LP-PLA2抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入Lp-PLA2，再与辣根过氧化物酶标记的Lp-PLA2抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。用酶标仪测定吸光度，通过标准曲线计算样品中Lp-PLA2的含量，但该方法重复性较差，精密度较低。新兴的化学发光免疫法(CLIA)、电化学发光免疫法(ECLI)和时间分辨免疫荧光法(TRFIA)等具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、操作简便、容易实现自动化的优点，是理想的临床微量生化检验的分析手段。但目前，具有自主知识产权的国产Lp-PLA2检测试剂盒较少，均依靠国外进口，价格昂贵，给患者带来很大经济负担，不利于基层普及。基于此，国内本领域的学者致力于NSE试剂盒的研发，如公开号为CN103698535B的中国专利申请“脂蛋白相关磷脂酶A2定量检测试剂盒及制备、操作方法”以免疫磁珠微粒与化学发光酶免疫分析技术相结合，具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数。又如公开号为CN104634970A的中国专利申请“用于检测脂蛋白相关磷脂酶A2的试剂盒及其制备和应用”以抗体包被磁球和示踪标记物标记抗体结合，用于检测Lp-PLA2，具有高重复性、高准确性和高灵敏度。电化学发光免疫法(ECLI)检测是在化学发光和电化学基础上发展而来的一种分析方法，其通过在电极上施加一定电压以引发电化学反应，电化学反应释放的能量再激发发光体，当激发态发光体返回基态时便产生光发射，从而可以根据光发射强度来实现对待测物的分析。目前没有基于ECLI技术用于检测Lp-PLA2的试剂盒相关研究。
技术实现思路
为解决现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2)试剂盒，采用该试剂盒进行Lp-PLA2检测具有较高的灵敏度和特异性，且操作简单，操作流程短。本专利技术另外一个目的在于提供一种所述快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒的使用方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。其中，脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。本专利技术提供的试剂盒为夹心法电化学发光免疫分析法与磁性微粒分离技术相结合的一种检测方法，基本原理为：利用脂质体将发光物质三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯进行包裹，利用间接法将抗体结合到脂质体的表面，具体为利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将表面包被链霉亲和素的脂质体与生物素化的抗体结合，制备脂质体复合物。此外，利用生物素与链霉亲和素的相互作用，将生物素化的抗体与链霉亲和素包被的磁性微粒进行络和，制备磁性分离试剂；将脂质体复合物、待测物质(抗原)、磁性分离试剂混合，在室温下充分反应，形成磁性微粒-抗原-脂质体复合物的“三明治”结构，具体为(链霉亲和素脂质体-生物素抗体)-抗原-(生物素抗体-链霉亲和素磁性微球)的结构，在外磁场的作用下，磁性微粒-抗原-脂质体复合物吸附于电极表面，加入反应缓冲液，使脂质体复合物释放出三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶出的三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯上的酰基与链霉亲和素上的氨基发生偶联反应形成酰胺键，通过链霉亲和素和生物素的相互作用，与抗体结合，开启电压后，发光底物及反应参与物在电极表面失去电子而被氧化。电子供体失去一个H+而成为强还原剂，将发光底物还原为激发态，随即释放光子而恢复为基态的发光底物。这一过程在电极表面周而复始地进行，不断地发出光子而常保持底物浓度的恒定。根据本专利技术的具体实施方案，本专利技术的快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒中，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体；(2)取50μL浓度为1x10-10mol/L的链霉亲和素与500μL步骤(1)制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体；(3)往步骤(2)制得的脂质体中加入生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。

【技术特征摘要】
1.一种快速诊断脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含：标准品和质控品、脂质体复合物、磁性分离试剂、分析缓冲液及清洗液。2.根据权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物的内部包被有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯，表面通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体；所述的磁性分离试剂为以含有氨基末端的磁微粒为载体，通过链霉亲和素-生物素的相互作用连接有抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。3.根据权利要求2所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的脂质体复合物的制备包括以下步骤：(1)取磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超声处理5min，然后在28℃，0.1MPa的条件下旋转蒸发，除去氯仿，静置30min，然后加入1mL三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液，在60℃水浴中振荡反应约1h，得脂质体悬浮液，将脂质体悬浮液超声处理3min，然后使用注射器式滤器调整脂质体的粒径至90～100nm，得到内部包裹有三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯的脂质体；(2)取50μL浓度为1x10-10mol/L的链霉亲和素与500μL步骤(1)制得的脂质体，混合，在室温下孵育1h，制得表面包被有链霉亲和素的脂质体；(3)往步骤(2)制得的脂质体中加入生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体，所述抗体在体系中的终浓度为10μg/mL，孵育12h，加入2％(w/v)BSA，继续孵育12h，以阻断脂质体表面上的非特异性位点，将得到的脂质体复合物置于4℃保存，即得脂质体复合物。4.根据权利要求3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的步骤(1)中磷脂酰胆碱、胆固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩尔比为10:8:2:0.6；所述的步骤(1)中三联吡啶钌的N-羟基琥珀酰亚胺酯溶液的制备为：取N-羟基琥珀酰亚胺酯，溶于二甲基甲酰胺中，制成质量浓度为3％的溶液。5.根据权利要求3所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的步骤(3)中生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体的制备包括以下步骤：取抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为1.0～2.0mg/mL的溶液；另取EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶于pH为7.2的PBS缓冲液中，制成浓度为10～20mM的溶液；然后取1mL浓度为1.0～2.0mg/mL的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体溶液与25μL的浓度为10～20mM的EZ-LinkSulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室温中反应1～2h，再使用PD-10的凝胶过滤器进行过滤，即得生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体。6.根据权利要求2所述的脂蛋白相关磷脂酶A2试剂盒，其特征在于，所述的磁性分离试剂的制备包括以下步骤：取1mL权利要求4制得的生物素化合的抗脂蛋白相关磷脂酶A2抗体与200μg的链霉亲和素包被的磁微粒混合，在室温条件下，100r/min反应1～2h，反应结束后，磁性分离，去上清，加入pH为7.4的Tris-HCl缓冲液反复洗涤多次，然后加入1mL浓度为0.2～0.4mM的D-生物素水溶液，室温下反应30min，以充分阻断未与生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈立国，邹伟权，张亚丽，李庆祥，母润红，王涛，苏焱，
申请(专利权)人：广州华弘生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44