一种自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，属于生物技术领域。本发明专利技术的目的是提供LP-PLA2-N端抗体，能特异性LP-PLA2-N端，不干扰LP-PLA2 C端酶催化结构区域酶活性，适合进行抗体扑获LP-PLA2酶活性测定试验，扑获出血液中LP-PLA2，或LP-PLA2-小分子复合物，再特异性测定LP-PLA2酶活性的自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程。本发明专利技术的步骤是：构建pVL1392-Flag-LP-PLA2载体，与线性AcNPV DNA 共转染产生重组Flag-LP-PLA2 AcNPV，表达出带有8个氨基酸残基短肽LP-PLA2，纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag-LP-PLA2蛋白，构建pVL1392-His-LP-PLA2-N载体，制备成His-LP-PLA2-N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP-PLA2-N端抗体。本发明专利技术测定LP-PLA2酶活性方法具有特异性强，应用广泛，检测灵敏度高的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
技术介绍
脂蛋白相关憐脂酶A2化ipoprotein-associatedphospholipaseA2,LP-PLA2)是 憐脂酶家族中PLA2的一种，有441个氨基酸残基的分泌蛋白（45KDa)，W酶活性形式循环在 血液中。LP-PLA2是丝氨酸依赖的憐脂酶，其催化活性不需要巧离子。LP-PLA2酶活性区 域位于蛋白C端，S273,D296,册51氨基酸残基组成酶催化活性核屯、位点；189-239氨基酸残 基形成片成结构，参与控制酶底物的特异性，并为低密度脂蛋白（LDL)结合区域；367-370 氨基酸残基参与高密度脂蛋白（皿L)结合。 血液中LP-PLA2来源有两类，一是由单核细胞、淋己细胞W及肥大细胞产生和分 泌到血液中；另一来源是由处于活动状态动脉血管硬化灶中的单核细胞，吞隧细胞产生并 分泌到血液中，其分泌量与动脉血管硬化灶活动程度相关。血液中LP-PLA2与LDL和皿L 相关，其中80%LP-PLA2与氧化低密度脂蛋白（OX-LDL)结合，10-20%LP-PLA2与DHL结合。 LP-PLA2憐脂酶能水解憐醋sn-2位短醋酷链中的醋键，血液中LP-PLA2能水解血小板活 化因子（Platelet-activatingfactor,PAF)，短链憐脂和氧化憐脂等。屯、脑血管疾病是最常见的中老年疾病，现在也是首位引起人类死亡原因。近些 年，随着生活水平的提高，屯、脑血管发病率呈年轻化趋势。研究表明，动脉硬化可累及冠 状动脉、脑动脉及其它动脉，是冠状动脉性屯、脏病，脑血栓和其它血栓疾病的病理基础。动 脉硬化是一种慢性炎症反应性疾病，炎症反应在动脉粥样斑块形成的起始、发展、破裂，脱 落等过程中起着重要作用，而LP-PLA2参与在动脉硬化炎症反应全过程并加重炎症反应。 组织学研究发现，活动性动脉硬化斑块内，斑块坏死中屯、、易损及破裂斑块周围，LP-PLA2浓 度显著升高。活动性动脉血管硬化灶内LP-PLA2水解与LDL结合氧化卵憐醋（0X-PC)，成为 溶血憐脂酷胆碱（IysoPC)和氧化游离脂肪酸（OX肥PAS)。运两个分解物是很强的炎症因 子，有单核巨隧细胞趋化因子作用，又能诱导血管内皮细胞分泌细胞粘附因子，促进单核细 胞移动到动脉血管硬化灶内，转化为巨隧细胞和泡沫细胞，损伤血管功能；运些聚集的巨隧 细胞和泡沫细胞产生更多的LP-PLA2,加重动脉硬化灶部位发炎，增生，导致血小板在此 部位积聚，脱落，形成血栓；同时，动脉血管硬化灶中的LP-PLA2大量分泌到血液中，增加 血液中LP-PLA2浓度。由此可见，LP-PLA2直接参于动脉硬化灶内炎症反应过程，血液中增 高LP-PLA2浓度和酶活性代表动脉硬化灶活动程度，也能代表血栓发生的可能性。 流行病学研究发现，血液中LP-PLA2浓度或酶活性增高人群，其屯、血管疾病发病 率增加。去除其它屯、血管疾病危险因素，与低浓度LP-PLA2人群相比，高浓度LP-PLA2人 群发生屯、血管疾病可能性增加2倍W上。又有研究发现，高血压人群，同时血液中LP-PLA2 浓度增高，发生屯、血管疾病可能性增加7倍W上。绝经后的妇女，伴有血液中LP-PLA2浓 度增高，发生血栓可能性增加64%。Gerber等人测定病人屯、肌梗死发生时血液中LP-PLA2 酶活性，比低LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人，高LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人死亡率增加 5. 35倍；有高LP-PLA2酶活性屯、肌梗死病人复发率增加两倍多。运些结果表明，血液中增 高LP-PLA2酶活性和浓度能预测屯、肌梗塞和脑血栓的发生，预后，及复发，需要开发测定血 液中LP-PLA2酶活性或浓度的试剂盒。 LP-PLA2是激发动脉硬化灶内炎症反应重要因子，促发血栓形成。开发LP-PLA2酶 活性抑制剂是阻断脉硬化灶内炎症反应有效途径，能减少血栓发生。在国外，葛兰素史克 公司研发出LP-PLA2酶活性抑制剂（Darapladib),能与LP-PLA2酶活性功能区丝氨酸残基 作用，并有效阻断血液中LP-PLA2酶活性，降低动脉硬化灶内炎症反应，减少血栓的发生。 在国内，需要开发LP-PLA2酶活性抑制剂，用于预防和减少血栓发生。 在临床检验中，检测血液中LP-PLA2浓度方法主要是夹屯、酶联免疫法，及直接测 定血液LP-PLA2酶活性方法，两个测定方法都需要纯化LP-PLA2作为标准品，此标准品要 有LP-PLA2自然酶活性和抗原性。制备出具有自然酶活性和抗原性纯化LP-PLA2蛋白有 几个途径。一是从人体血液中大量提取自然LP-PLA2,运种方法是不可行，原因是血液来 源受限制，血液中有多种感染因子，制备过程和标准品是不安全。再用基因工程方法表达 和纯化LP-PLA2标准品，用基因工程细菌表达LP-PLA2蛋白没有酶活性，蛋白结构与自然 LP-PLA2有很大差异，不能作为LP-PLA2标准品；用人体细胞表达LP-PLA2基因重组蛋白 符合LP-PLA2标准品的要求，但培养人体细胞要求条件高，产量低，生产成本高；而本专利技术 采用昆虫细胞系统表达LP-PLA2,昆虫细胞近似于人体细胞，但产量高，成本低，适合大量生 产，纯化出LP-PLA2具有自然酶活性和抗原性，作为检测LP-PLA2酶活性和浓度的标准品。 测定血液中LP-PLA2浓度方法是双抗体夹屯、酶联免疫法，利用抗原和抗体特异性 结合的原理。此法简单，易操作，得到广泛应用。但运种方法测定血液中LP-PLA2的含量， 间接表明血液中LP-PLA2酶活性，而动脉硬化活动状况与血液中LP-PLA2酶活性相关，有时 LP-PLA2含量与LP-PLA2活性是不相关，如LP-PLA2基因变异人群及血液中有LP-PLA2抑 制物的人群；另外，制备测定LP-PLA2双抗体夹屯、酶联免疫法试剂盒需要几种LP-PLA2单克 隆抗体，成本高；同时，双抗体夹屯、酶联免疫法步骤多，需要时间较长，准确性差等缺点。 直接测定血液LP-PLA2酶活性方法是利用LP-PLA2为憐脂酶，能水解氧化憐 醋sn-2位短醋酷链中的醋键，在实验研究工作中，用合成LP-PLA2酶底物，直接测定 LP-PLA2酶活性。其方法是直接加LP-PLA2酶底物到血清/血浆中，其中LP-PLA2分解合成 反应底物，生成颜色反应产物，再测算出LP-PLA2酶活性。运种方法优点为简洁，快速。缺 点是血液一些成分直接影响检测LP-PLA2酶活性法的结果，如血红素，胆红素，代谢产物， 药物等；血液或细胞液中还有LP-PLA2类似PLA2憐脂酶存在，也能水解LP-PLA2酶底物，测 定酶活性结果一部分为PLA2憐脂酶的活性，降低检测血液LP-PLA2酶活性的特异性。 一些植物提取物中的小分子能与LP-PLA2-C端酶活性区结合形成复合物，并抑制 LP-PLA2酶活性，成为LP-PLA2酶活性抑制剂，为了开发出植物中小分子LP-PLA2酶抑制剂， 需要一种检测LP-PLA2-小分子复合物酶活性方法。 双抗体夹屯、酶联免疫法是用于测定样品中LP-PLA2含量，不能测定LP-PLA2酶活 性，不能用于筛选LP-PLA2酶活性抑制剂。用酶底物直接测定样品中LP-PLA2酶活本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种自然酶活性脂蛋白相关磷脂酶A2及制备过程，其特征在于：提取THP‑1 RNA，合成THP‑1 cDNA基因库，用PCR扩增出LP‑PLA2 DNA，构建pVL1392‑Flag‑LP‑PLA2载体；pVL1392‑Flag‑LP‑PLA2载体与线性AcNPV DNA 共转染到SF9细胞，产生重组Flag‑LP‑PLA2 AcNPV；重组Flag‑LP‑PLA2 AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基短肽LP‑PLA2；用Anti‑Flag M2 affinity agarose纯化出具有自然酶活性和抗原性Flag‑LP‑PLA2 蛋白；构建pVL1392‑His‑LP‑PLA2‑N载体，产生重组His‑LP‑PLA2‑N AcNPV，感染SF9细胞并表达出带有6个氨基酸残基短肽LP‑PLA2‑N；His‑Select HF Nickel affinity Gel纯化出His‑LP‑PLA2‑N端蛋白并制备成His‑LP‑PLA2‑N端蛋白亲和层析柱；Flag‑LP‑PLA2免疫动物产生LP‑PLA2抗血清，用His‑LP‑PLA2‑N端蛋白亲和层析柱，分离和纯化出抗LP‑PLA2‑N端抗体。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：关大伟，李宝民，刘木清，于顺，蔡燕宁，高大松，关恒，赵雪，
申请(专利权)人：长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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