本发明专利技术涉及一种深海沉积物来源酯酶Est2及其编码基因与应用。一种深海来源酯酶基因Est2由宏基因组筛选获得，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术所述的酯酶基因经异源表达后，底物为对硝基苯酚己酸酯(C6)时催化活性最高，酶活达386U/mg。酯酶Est2反应温度范围为10～55℃，最适反应温度为45℃，反应pH范围为6.0～10.0，最适pH为7.5，EDTA和吐温20可增强其活性。该酯酶可广泛应用于手性药物合成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革绢纺原料脱脂、废水处理、洗涤工业等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种深海沉积物来源酯酶Est2、其编码基因 及其应用。
技术介绍
脂类水解酶（lipolyticenzymes)广泛存在于微生物中，能够催化酯类化合物的 水解和合成，根据催化作用方式和底物链的长短可以分为酯酶（esterase，EC3. 1. 1. 1)和 脂肪酶（lipase，EC3. 1. 1. 3)。脂类水解酶具有许多优良的特性，例如具有高度手性选择特 异性，催化反应不需要辅酶和辅因子，拥有较广的底物谱，在有机溶液中保持高稳定性等， 使得脂类水解酶在工业生产中成为重要的催化剂。脂类水解酶可广泛应用于手性药物合 成、食品加工及食品风味改良、油脂水解、皮革絹纺原料脱脂、废水处理和洗涤工业等方面。 目前已经有许多微生物分泌的脂肪酶得到了商业化生产，并应用于生产生活的各个方面。 传统的微生物分离和纯培养方法，是获得微生物及其基因资源的重要基础。然而， 因无法再现微生物的原位生境条件等原因，绝大多数微生物难以在实验室获得纯培养。特 别是海洋微生物的可培养率不到1 %，限制了我们对海洋微生物基因资源的发掘与应用。宏 基因组，直接研究环境中的微生物DNA，克服了传统方法的困难，成为了获取海洋微生物基 因资源的有力手段，大大开拓了微生物基因资源的来源。目前，宏基因组研究方法已经广泛 应用于土壤、淡水、海水、海洋沉积物等环境中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新的深海来源酯酶、其编码基因及其制备方法，该酯酶 可用于酯类降解及其他酯类化合物的生物催化和转化。 本专利技术从太平洋海山深海沉积物宏基因组文库中，通过特异性底物（三丁酸甘油 酯）筛选获得一种新的酯酶基因Est2,经PCR、酶切、克隆和测序，酯酶基因Est2的核苷酸 序列如SEQIDNo. 1所示。酯酶基因Est2大小为921bp，碱基组成为：136A(14. 77%)、 135T(14. 66 % )、383C(41. 59 % )和267G(28. 99 % )，编码蛋白大小为306个氨基酸残基，其 氨基酸序列如SEQIDN〇:2所示。将该基因序列在GenBank中进行同源搜索，与之相似性 最高的酯酶来源于活性污泥的宏基因组，相似性为73% (其在GenBank数据库中的注册号 为ADM67447)。系统发育分析结果表明，酯酶Est2属于酯酶家族中的第IV家族。氨基酸序 列分析结果显示，酯酶Est2具有甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、丙氨酸和甘氨酸组成的催化结 构域（氨基酸位置为142至146)，构成酯酶催化中心，说明Est2属于酯酶第IV家族⑶SAG 亚家族。综上所述，Est2应为酯酶家族中的一名新成员。 在不影响酯酶Est2蛋白活性前提下，可对SEQIDN0:2所示的远离142-146氨基 酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Est2 活性的衍生蛋白质。根据本领域技术的公知常识，蛋白质的生物学活性是和其功能结构域 密切相关的。一般来说，只有发生在功能结构域的位点突变可能对蛋白质的二维和三维结 构产生影响，从而影响其生物学活性。而对于发生在远离功能结构域的氨基酸位点，由于这 一区域不参与蛋白功能构象，因而氨基酸的个别点突变不会对蛋白质的生物学活性产生实 质性影响，从而能够基本保留原蛋白质的生物学功能。优选的酯酶Est2突变体具有至少与 SEQIDN0:2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，更优选具有至少95%以上的同源性，最 优选具有至少99%以上的同源性。 同理，本专利技术还保护对SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列进行的替换、添加和/或缺 失一个或几个核苷酸从而获得编码能基本保留酯酶Est2蛋白生物学活性的DNA分子。优 选的酯酶Est2突变体基因具有至少与SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列90%以上的同源性， 更优选具有至少95%以上的同源性，最优选具有至少99%以上的同源性。 利用基因克隆技术，可将克隆到的酯酶Est2基因连接到合适的载体上，并转化或 转染到原核生物或真核生物宿主表达制备重组酯酶Est2。合适的原核生物宿主包括各种细 菌如E.coli等，合适的真核生物宿主包括酵母（如甲醇酵母）及哺乳动物细胞（如中国仓 鼠卵巢细胞）等，优选采用原核表达系统E.coli。 合适的载体为本领域技术人员所熟知的各种可商业化购买的原核或真核表达 载体。一个优选的例子是将本专利技术筛选到的酯酶基因Est2连接到大肠杆菌表达载体 pET28b(Novagen)上，并转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，经诱导表达出高活性的重组酯 酶。通过酯酶活力测定表明，Est2酯酶或上述能表达Est2酯酶的宿主菌可用于水解短链 脂肪酸脂，例如C2-C8短碳链脂肪酸酯。优选的短链脂肪酸脂为具有C2-C8短碳链的对硝 基苯酚酯，例如对硝基苯乙酸酯、对硝基苯丁酸酯、对硝基苯己酸酯或对硝基苯辛酸酯等， 其中底物为对硝基苯酚乙酸酯（C6)时催化活性最高，酶活达386U/mg。 Est2酯酶催化水解温度范围为10~55°C，优选为40~50°C;所述水解的pH值 为6. 0~10. 0,优选为7. 0~7. 5。在添加EDTA或吐温20条件下，酶学活性增大。本专利技术 提供的新型酯酶及其编码基因在医药制备、食品加工及风味改良、废水处理、洗涤行业具有 重要的应用潜力。【附图说明】 图1为纯化酯酶Est2的聚乙酰胺凝胶电泳分析图。 图2为酯酶Est2的底物特异性图。C2 :对硝基苯乙酸酯；C4 :对硝基苯丁酸酯、C6 : 对硝基苯己酸酯；C8 :对硝基苯辛酸酯；C10 :对硝基苯癸酸酯；C12 :对硝基苯十二酸酯；定 义底物为C6时测定值为100 %。 图3为酯酶Est2最适反应温度图。 图4为酯酶Est2最适反应pH图。 图5为二价阳离子对酯酶Est2活性影响图。 图6为有机溶剂和去垢剂对酯酶Est2活性影响图。【具体实施方式】 实施例1酯酶基因Est2的获取 深海沉积物样品于2008年由深海可视多管取样器采集自太平洋海山边缘。宏 基因组文库构建米用CopyControl?HTPfosmidlibraryproductionkit(Epicentre Biotechnologies，美国），宿主菌株为E. coli EPI300 (Epicentre Biotechnologies，美 国），载体为pCC2F0S fosmid vector (Epicentre Biotechnologies，美国）。经脉冲场电泳 检测，插入片段大小为36~48kb。 采用酯酶筛选平板筛选具有酯酶基因的克隆子。酯酶筛选培养基配方为LB培养 基（l〇g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，pH 7. 2)中加入10g/L三丁酸甘油 酯；灭菌后，无菌条件下加入氯霉素，使其终浓度为12.5 yg ml1。取10yl文库菌液稀释 至100yl，涂布于酯酶筛选平板，30°C培养2天，菌落周围出现明显透明圈即为阳性克隆。 将阳性克隆挑出，经重复验证获得酯酶克隆E2。 经重复验证的酯酶阳性克隆E2接入3mlLB液体培养基（含12. 5ygml1氯霉素 和 6ylCopyControl?FosmidAutoindu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酯酶Est2，是具有如下(1)或(2)特征的蛋白质：(1)、其氨基酸序列与Seq ID NO.2所示序列一致；(2)、对SEQ ID NO:2所示的远离142‑146氨基酸位置的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有酯酶Est2活性的衍生蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：霍颖异，许学伟，尹帅，崔恒林，王春生，
申请(专利权)人：国家海洋局第二海洋研究所，中国大洋矿产资源研究开发协会，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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