脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂及制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。由R1试剂、R2试剂、R3试剂及标准样构成，所述的R1试剂是由乙二胺四乙酸二钠溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂为添加有缓冲液的纯化水溶液；所述的R3试剂是由1‑肉豆蔻酰‑2‑（4‑硝基苯基琥珀酰基）‑sn‑丙三基‑3‑磷酸胆碱溶解于添加有乙醇的纯化水中所形成的溶液；所述的标准样是由脂蛋白相关磷脂酶A2、缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠溶解于纯化水中所形成的溶液。将发明专利技术应用于脂蛋白相关磷脂酶A2的测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂及其制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料

技术介绍
人血浆脂蛋白相关磷脂酶A2(Lp-PLA2，也称为血小板活化因子乙酰水解酶)，是由成熟的巨噬细胞和淋巴细胞合成和分泌，并受炎症介质的调节；也是一种在动脉粥样硬化斑块中常见的炎症酶，为水解氧化磷脂生成促炎产物，会导致内皮功能障碍、斑块炎症以及斑块中坏死核心的形成。血液循环中的Lp-PLA2大多以结合脂蛋白颗粒的形式存在，主要与低密度脂蛋白(LDL)结合，少量结合高密度脂蛋白和极低密度脂蛋白。Lp-PLA2与其他人体磷脂酶A2(如分泌磷脂酶)可通过转化膜状甘油磷脂为早期花生四烯酸来传播炎症。临床证明：人血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)比胆固醇、低密度脂蛋白判断爆发性心脑血管栓塞特异性高，具体如下：(1)动脉粥样硬化的炎症发展到严重程度，将要或已经出现向血管内腔破裂时，人血浆脂蛋白磷脂酶A2(Lp-PLA2)将会被大量释放入血液，使血液内的水平会大幅度升高，因此Lp-PLA2在血液中的浓度能够反映动脉粥样硬化斑块的炎症程度及其稳定性。(2)血清脂蛋白相关磷脂酶A2含量升高程度与心脑血管的病理发展进程呈正相关，是临床判断心脑血管程度和预后的很好的指标。(3)脑卒中(Stroke)是常见的心脑血管疾病之一，具有发病率高、致残致死率高的特点。70％以上脑卒中患者属于缺血性卒中，而60％-80％的缺血性卒中患者是由动脉粥样硬化(AS)所致。在AS的发生、发展、斑块形成及破裂等过程中，脂蛋白相关磷脂酶A2具有促动脉粥样硬化的作用,而参与其中。脑卒中患者血浆Lp-PLA2水平显著升高，并与神经功能缺损程度、超敏C反应蛋白及血压具有相关性，因此脂蛋白相关磷脂酶A2在脑卒中的诊断预测及治疗、预后中具有重要意义。(4)原发性高血压时，血浆中Lp-PLA2CG水平随着血压的升高而升高。目前国内测定脂蛋白相关磷脂酶A2的方法主要有：(1)化学发光法，该方法虽然灵敏度高，但不稳定。(2)分光光度法，该方法操作简单，快速，但准确度相对不高。(3)酶联免疫法，该方法定量准确性差，操作时间长，自动化程度低。基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有脂蛋白相关磷脂酶A2在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、操作简便，采用国内外先进的连续监测法，适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，由R1试剂、R2试剂、R3试剂及标准样构成，所述的R1试剂是由乙二胺四乙酸二钠溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂为添加有缓冲液的纯化水溶液；所述的R3试剂是由1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱溶解于添加有乙醇的纯化水中所形成的溶液；所述的标准样是由脂蛋白相关磷脂酶A2、缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠溶解于纯化水中所形成的溶液。进一步的，作为优选：所述的R1试剂中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。更优选的，乙二胺四乙酸二钠的浓度为50mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH是7.6，浓度为500mmol/L。所述的R2试剂中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，更优选的，所述的磷酸盐缓冲液的pH是7.6，其浓度为200mmol/L。所述的R3试剂中，1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的浓度200mmol/L；乙醇的浓度为99％。所述的标准样中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，牛血清蛋白浓度为0.1％，叠氮钠的浓度为0.1％，脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度为300U/L。更优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L。同时，本申请还提供了一种具有上述特征脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1试剂配制：向容器中的纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入乙二胺四乙酸二钠搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(2)R2试剂配制：向容器中的纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解后定容；(3)R3试剂配制：向容器中的纯化水中加入乙醇，添加1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱，搅拌至完全溶解后定容；(4)标准样配制：向缓冲液中加入脂蛋白相关磷脂酶A2，搅拌至完全溶解；加入牛血清蛋白搅拌至溶解，加入叠氮钠搅拌至完全溶解，加纯化水继续搅拌后定容；(5)对上述制备的R1试剂、R2试剂和R3试剂及标准样的灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。进一步的，作为优选：所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大，影响所配制溶体的表面张力和粘合力，搅拌速度过低则影响其混配效果，控制在450转/分时，在确保搅拌剪切适中的同时，也促进了其内所添加物质的融合。步骤(1)中，所述的纯化水的初始体积800ml，定容体积为1000ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(2)中，所述的缓冲液为250ml。步骤(3)中，纯化水的初始体积为10ml，定容体积为12.5ml。定容前后体积变化在20-30％以内，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R3试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(4)中，所述的纯化水的初始体积为80ml，定容体积为100ml。定容前后体积变化在20-30％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的标准样浓度、溶液稳定性最佳。本专利技术的工作原理如下：本申请为以1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱为底物的连续监测法。LP-PLA2水解底物1-肉豆蔻酰-2-(4-硝基苯基琥珀酰基)-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的sn位点，生产4-硝基苯基琥珀酰，其在水溶液中降解后生成的对硝基酚可通过光学系统进行检测，通过特定波长下吸光度的变化即可检测出LP-PLA2的活性。(1)灵敏度评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度变化率(ΔA/min)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度100U/L吸光度变化率(ΔA/min)≥0.002ABS/min。(2)线性范围评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。(3)精密度评价试验精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测本文档来自技高网...

【技术保护点】
脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：由R1试剂、R2试剂、R3试剂及标准样构成，所述的R1试剂是由乙二胺四乙酸二钠溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂为添加有缓冲液的纯化水溶液；所述的R3试剂是由1‑肉豆蔻酰‑2‑（4‑硝基苯基琥珀酰基）‑sn‑丙三基‑3‑磷酸胆碱溶解于添加有乙醇的纯化水中所形成的溶液；所述的标准样是由脂蛋白相关磷脂酶A2、缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠溶解于纯化水中所形成的溶液。

【技术特征摘要】
1.脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：由R1试剂、R2试剂、R3试剂及标准样构成，所述的R1试剂是由乙二胺四乙酸二钠溶解于添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂为添加有缓冲液的纯化水溶液；所述的R3试剂是由1-肉豆蔻酰-2-（4-硝基苯基琥珀酰基）-sn-丙三基-3-磷酸胆碱溶解于添加有乙醇的纯化水中所形成的溶液；所述的标准样是由脂蛋白相关磷脂酶A2、缓冲液、牛血清蛋白和叠氮钠溶解于纯化水中所形成的溶液。2.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：所述的R1试剂中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。3.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：所述的R2试剂中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。4.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：所述的R3试剂中，1-肉豆蔻酰-2-（4-硝基苯基琥珀酰基）-sn-丙三基-3-磷酸胆碱的浓度200mmol/L；乙醇的浓度为99%。5.如权利要求1所述的脂蛋白相关磷脂酶A2的测定试剂，其特征在于：所述的标准样中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，牛血清蛋白浓度为0.1%，叠氮钠的浓度为0.1%，脂蛋白相关磷脂酶A2的浓度300U/L。6.如权利要求1-5任一项所述脂蛋白相关磷脂酶A2测定试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）R1试剂配制：...

【专利技术属性】
技术研发人员：方朝君，
申请(专利权)人：浙江达美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33