藻类和水生植物中生物有效磷的分析方法技术

本发明专利技术涉及藻类和水生植物中生物有效磷的分析方法，分别通过液态31P‑NMR技术和酶水解法分析湖泊藻类和水生植物中的详细磷组分并进行对比分析，发现两种方法检测出的磷组分具有类似性，其中液态31P‑NMR技术检测出藻类和水生植物含有超过15种以上磷组分，而酶水解法发现水解能力较强的是植酸磷和活性单酯磷组分，分别占总可水解有机磷的50.2％和43.5％；再添加各种酶培养来研究湖泊藻类和水生植物中的生物有效磷，发现二者有机磷中的大部分单酯磷和焦磷酸盐均不同程度的水解为生物可直接利用的正磷酸盐，为藻类再次暴发提供了充足的营养物质，待外界环境条件适宜时，藻类将循环往复暴发，为湖泊生态系统以及人类饮水安全带来巨大隐患。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物有效磷的分析方法，具体涉及藻类和水生植物生物有效磷的液态31P-NMR和酶水解分析方法。
技术介绍
有机磷在湖泊水体、沉积物以及水生植物均存在，其可以通过一系列氧化还原环境以及酶水解过程中转化为生物有效磷(即生物可直接吸收利用的磷，如正磷酸盐等)。Zhu[1]报道沉积物中有机磷含量平均为454mg/kg，水生植物和藻类的有机磷浓度分别沉积物的1.8倍和12.9倍。尽管湖泊内源有机磷在富营养化过程中发挥着重要作用，但是研究藻类和水生植物中有机磷的组成结构及其在湖泊内源磷中的循环过程还鲜有报道。液态磷核磁共振光谱技术(31P-NMR)作为一种有效的表征手段应用于沉积物等水环境样品中。在水生系统中主要有三大类有机磷组分，即单酯磷、二酯磷和膦酸盐。31P-NMR光谱技术还可以将单酯磷进一步表征为详细的磷组分，如糖磷(葡萄糖6磷酸、葡萄糖1磷酸等)、肌醇磷酸盐(IHP)、磷脂、DNA以及RNA等。除此以外，酶水解法是另外一种表征有机磷的方法，一般在动物肥料、土壤以及其他陆地样品中均有应用。该方法添加各种酶后可以将有机磷水解为无机磷。在湖泊生态系统中，该方法一般应用于沉积物中。例如，这种方法把沉积物中的磷分为活性单酯磷、二酯磷和类植酸磷。在湖泊生态系统中，酶水解分析方法应用于湖泊藻类和水生植物中还鲜有报道。也有研究把31P-NMR光谱技术和酶水解法结合起来应用于动物肥料、土壤以及沉积物[22]中。但是将此两种方法相结合应用于藻类和水生植物中，以此来分析富营养化湖泊内源磷循环机理以及生物可利用性还未见报道。因此，在该研究中，将藻类和水生植物样品利用这两种手段进行深入的研究，并且比较这两种手段在湖泊藻类和水生植物中有机磷组成结构中的差异，并且利用31P-NMR光谱技术分析在酶解前后湖泊藻类和水生植物有机磷的生物可利用性，为更好的探索内源磷在富营养化湖泊中的循环过程提供科学依据。[1]Zhu，Y.；Zhang，R.；Wu，F.，etal.PhosphorusfractionsandbioavailabilityinrelationtoparticlesizecharacteristicsinsedimentsfromLakeHongfeng，SouthwestChina[J].EnvironmentalEarthSciences，2013，68(4)：1041-1052.
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的缺陷，提供一种藻类和水生植物生物有效磷的31P-NMR和酶水解分析方法，该方法可以准确、快捷的分析湖泊藻类和水生植物中的生物有效磷。本专利技术的技术方案为：一种藻类和水生植物生物有效磷的分析方法，包括以下步骤：(一)酶水解法(1)酶溶液的制备碱性磷酸酶(APase)溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为1U/mL；碱性磷酸酶和磷酸二酯酶(PDEase)组合溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.02U/mL；碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.06U/mL；(2)培养液的制备取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入盐酸调节所述浸提液的pH值至中性，再加入50倍所述浸提液体积的超纯水和0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入2.5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶溶液，得培养液1；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶(PDEase)组合溶液，然后加入50倍所述浸提液体积的超纯水，得培养液2；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入50倍所述浸提液体积的超纯水，再加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；(3)培养16h后，向培养液中加入显色剂，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷酸盐的差值为有机磷水解量，即生物有效磷量；(二)31P-NMR分析法(1)取100mg冷干后的藻类或水生植物NaOH-EDTA提取液粉末用1mL1mol/LNaOH-0.1mol/LEDTA重新溶解；(2)加入重水，在室温条件下静置30min，再用10000r/min转速离心30min；(3)转移至核磁管中，贮存在4℃条件下，24h之内测定液态31P-NMR；(4)对步骤(3)中得到的谱图进行积分得到生物有效磷量。进一步地，所述藻类或水生植物浸提液采用0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA提取剂进行提取，所述藻类或水生植物粉末与所述提取剂的质量体积为1∶60。用0.5mol/LNaOH+25mmol/LEDTA作为提取剂，水生植物TP和Po的提取率分别是92.4％和88.1％，藻类TP和Po的提取率分别是96.4％和90.8％，较高的提取率不需要HCl等溶液进行二次提取。进一步地，所述植酸酶由粗品植酸酶(Phytase)提纯后得到，提纯方法为：a.取粗品植酸酶，用pH＝5.0-5.5，8-12mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液进行溶解，转移至透析管中，悬浮在pH＝5.0-5.5，8-12mmol/LNaAc-HAc缓冲溶液中透析，每隔2～4h更换烧杯中透析液一次，连续更换5～7次；b.透析后的酶溶液在8000-12000r/min转速下离心5-15min；c.提纯后的植酸酶溶液保存在4℃环境中，一周内使用。更进一步地，对所述提纯后植酸酶进行活性测试，所述活性测试的方法包括以下步骤：取两支离心管，分为检验组和对照组，往两组离心管中均加入0.5mL的1mmol/L硝基苯磷酸二钠盐(PNPP)溶液，再向检验组中加入0.2mL的1U/mL提纯后的植酸酶溶液和1mL0.01mol/LpH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，向对照组中只加入1.2mL0.01mol/LpH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，等待3-5分钟，若检验组中的溶液变黄色，而对照组中的溶液仍为无色，则说明提纯后的植酸酶仍具有活性，可以继续下一步的实验操作。进一步地，所述培养液还含有0.5-2％的十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate，SDS)，优选为1％的十二烷基硫酸钠，以防止在测定过程中可能因为酸化而产生酶蛋白沉淀等干扰磷的测定。进一步地，所述31P-NMR分析采用BRUKER标准腔5mmBBO探头，31P的共振频率为161.98Hz，测定温度为20℃，谱峰宽度为5Hz，获取时间AQ为0.2102s，NMR参数中延迟时间D1的设置为5s，分析测试时间为15h。本专利技术优选活性为1U/mL的碱性磷酸酶溶液，活性为0.02U/mL的碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，活性为0.06U本文档来自技高网...

【技术保护点】
藻类和水生植物生物有效磷酶水解和液态31P‑NMR分析方法，包括以下步骤：(一)酶水解法(1)酶溶液的制备碱性磷酸酶溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris‑HCl缓冲溶液配置，活性为1U/mL；碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris‑HCl缓冲溶液配置，活性为0.02U/mL；碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝7.0的Tris‑HCl缓冲溶液配置，活性为0.06U/mL；(2)培养液的制备取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入盐酸调节所述浸提液的pH值至中性，再加入50倍所述浸提液体积的超纯水和10倍0.1mol/L，pH＝9.0的Tris‑HCl缓冲溶液，再加入2.5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶溶液，得培养液1；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝9.0的Tris‑HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，然后加入50倍所述浸提液体积的超纯水，得培养液2；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入50倍所述浸提液体积的超纯水，再加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝7.0的Tris‑HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；(3)培养16h后，向培养液中加入显色剂，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷酸盐的差值为有机磷水解量，即生物有效磷量；(二)31P‑NMR分析法(1)取100mg冷干后的藻类或水生植物的NaOH‑EDTA提取液粉末用1mL1mol/L NaOH‑0.1mol/LEDTA重新溶解；(2)加入重水，在室温条件下静置30min，再用10000r/min转速离心30min；(3)转移至核磁管中，贮存在4℃条件下，24h之内测定液态31P‑NMR；(4)对步骤(3)中得到的谱图进行积分得到生物有效磷量。...

【技术特征摘要】
1.藻类和水生植物生物有效磷酶水解和液态31P-NMR分析方法，包括以下步骤：(一)酶水解法(1)酶溶液的制备碱性磷酸酶溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为1U/mL；碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.02U/mL；碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液由0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液配置，活性为0.06U/mL；(2)培养液的制备取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入盐酸调节所述浸提液的pH值至中性，再加入50倍所述浸提液体积的超纯水和10倍0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入2.5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶溶液，得培养液1；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝9.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶和磷酸二酯酶组合溶液，然后加入50倍所述浸提液体积的超纯水，得培养液2；取藻类或水生植物浸提液于比色管中，加入50倍所述浸提液体积的超纯水，再加入10倍所述浸提液体积0.1mol/L，pH＝7.0的Tris-HCl缓冲溶液，再加入5倍所述浸提液体积的所述碱性磷酸酶、磷酸二酯酶和植酸酶组合溶液，得培养液3；所述配制好的培养液1、培养液2和培养液3，分别培养在37℃恒温培养箱中，转速为220r/min；(3)培养16h后，向培养液中加入显色剂，10min后，采用磷钼蓝比色法测酶培养前后的磷酸盐；(4)显色后使用紫外可见分光计分析，培养后测定的磷酸盐与培养前测定的磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯伟莹，吴丰昌，朱元荣，宋凡浩，白英臣，
申请(专利权)人：中国环境科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京;11