具有磷脂酶A活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有磷脂酶A活性的分离的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】具有磷脂酶A活性的多肽与对其进行编码的多核苷酸 对序列表的引用 本申请包含一个计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。 专利技术背景 专利
本专利技术涉及具有磷脂酶A活性的多肽和编码这些多肽的多核苷酸。本专利技术还涉及 包括这些多核苷酸的核酸构建体、载体以及宿主细胞连同产生和使用这些多肽的方法。 相关技术说明 已从大量的有机体中分离出了磷脂酶，例如动物、植物、细菌、真菌。 来自黑曲霉的脂肪酶（UNIPROT :B8HE6)具有一种氨基酸序列，该氨基酸序列与 本专利技术的磷脂酶具有70%的一致性。 具有A1活性的磷脂酶已经由诺维信A/S公司以LECITASE ULTRA向公众开放（扬_ (Yang)等人,食品技术和牛物技术（Food Technol. Biotechnol.) ,44(1) 101-104(2006))〇 本领域已知磷脂酶的数个用途，例如将磷脂酶用于，例如植物油的酶法脱胶（杨 (Yang)等人，见上文；US 5,264,367，Metallgesellschaft，R6hm);淀粉水解产物的处理 (特别是来自小麦淀粉）以改善滤过率伍？ 219,269,0?(：国际）；作为一种面包面团的添加 剂以改善面团和面包的特性（1^ 4,567,046，协和发酵（办〇?&他1^〇));并且用于制备具 有特殊的乳化性能的溶血卵磷脂。 可以将磷脂酶应用于植物油的脱胶以提供具有适于消费的中性味道和浅色的精 炼贮存稳定的植物油。脱胶过程包括去除磷脂化合物，该磷脂化合物又称磷脂类或来自富 含三酸甘油脂的油级分的"胶"。 传统上，脱胶过程基于水萃取，用酸处理或腐蚀性处理，随后经过分离过程。由于 磷脂类的乳化性，脱胶流程导致了油的损失，即，甘油三酯的损失。然而，酶法脱胶已经变得 越来越普遍。酶法脱胶是在已经进行过了水脱胶的油上以及在粗油上进行。在食用油的水 脱胶过程中，磷脂类的一部分被留在该油中。那部分用通用术语"非水化磷脂类"（NHP)来 描述。在生产油的过程中，去除NHP含分是必不可少的（US 5264367)。在酶法脱胶过程中， 通过使用磷脂酶将NHP转化为溶于水的并且水可提取的组分。 针对植物油的工业脱胶应用最广泛的商业酶是来自诺维信A/S公司的磷脂酶 LECITASE ULTRA (杨（Yang)等人，见上文）。LECITASE ULTRA具有相对高的热稳定性；然 而，其最适合用于温度最高不超过55°C的脱胶过程。 一般通过使用酸性的和腐蚀性的化学品协助酶法脱胶。在初始脱胶步骤中，通过 将金属与柠檬酸盐螯合，柠檬酸或磷酸的添加改善了磷脂的盐形式的水合性。在以下酶促 反应中，pH经常需要被部分中和（典型地通过添加氢氧化钠）以适应所应用的酶的pH需 要。当使用磷脂酶LECITASE ULTRA时，针对此反应的最适pH为在5.0和5.5之间（参见申 请表"植物油的精炼-改善脱胶产率（Refining of vegetable oils-Improving degumming yield) "）。然而，在此pH范围内，在酶促反应期间所释放的钙和/或镁与用来控制反应条 件的缓冲液或螯合酸结合，典型地导致盐形成并且导致因柠檬酸钙和柠檬酸镁的盐的沉淀 的设备污染（US 7, 713, 727)。如果酶促反应可以在较低pH下进行由此减少用于中和所使 用的酸将是有利的。 对于提供具有改善性质的新颖磷脂酶是一直存在的需要的，例如在高温和/或低 pH下提高活性。本专利技术涉及具有磷脂酶A活性的此类新颖的多肽和编码这些多肽的多核苷 酸。 专利技术概述 本专利技术人已经鉴定出了一种来自嗜热篮状菌（Talaromyces leycettanus)菌株 CBS398. 68的具有磷脂酶A活性的新型多肽。本专利技术的多肽示出了在高温下的高热稳定性 和/或提高的活性。因为它允许在较高温度下进行工业过程，这是一种优点。在酶法脱胶 中，较高的温度可以提高存在于油中的磷脂类的酶法脱胶的速度，有助于在磷脂类的酶法 降解后的油相和水相的分离，和/或降低油的粘度-所有以上这些导致较短的加工时间以 及油脂精炼设备的较高物料通过量。 此外，本专利技术的多肽在低pH下具有出乎意料高的活性，这是一种优点，即，在植物 油的酶法脱胶中，其中pH调节的需要被降低，导致工艺设备的沉淀的较少的沉积并且因此 节省了所减少使用的化学品连同降低了用于清洁的时间。 多肽对大多数磷脂具有活性，包括磷脂酸（PA)、磷脂酰乙醇胺（PE)、磷脂酰肌醇 (PI)、和磷脂酰胆碱（PC)。 因此，本专利技术提供了具有磷脂酶A活性的新颖多肽和编码这些多肽的多核苷酸。 在第一方面，本专利技术涉及具有磷脂酶A活性的分离多肽，所述分离多肽选自下组， 该组由以下各项组成：（a) -种多肽，该与多肽SEQ ID N0:2的成熟多肽或SEQ ID N0:3的 多肽具有至少80%的序列一致性；(b) -种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸 在高严格条件下与（i)SEQ ID N0:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或（ii) (i)的全 长互补体杂交；（c) 一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO: 1的 成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少65%序列一致性；（d) SEQ ID NO: 2的成熟多 肽的的变体或SEQ ID NO:3的多肽的变体，该变体在一个或多个位置处包括取代、缺失、和 /或插入；和（e) (a)、（b)、（c)、或（d)的多肽的片段，该片段具有磷脂酶A活性。 在第二方面，本专利技术涉及分离的核酸，所述分离的核酸选自下组，该组由以下各项 组成：(a) -种核苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多 肽包括SEQ ID N0:2的成熟多肽或SEQ ID N0:3的多肽；(b) -种核苷酸序列，该核苷酸序 列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中所述多肽包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列 与SEQ ID N0:2的成熟多肽或与SEQ ID N0:3的多肽具有至少80%的一致性；（c) 一种核 苷酸序列，该核苷酸序列编码一种具有磷脂酶A活性的多肽，其中该核苷酸序列包括SEQ ID NO: 1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列；(d) -种核苷酸序列，该核苷酸序列与根据（a)、 (b)、或（c)的核苷酸序列具有至少80 %的序列一致性；（e) -种核苷酸序列，该核苷酸序列 在高严格条件下与根据（a)、（b)、（c)、或（d)的核苷酸序列的互补链杂交；（f)根据（a)、 (b)、（c)、（d)、或（e)的核苷酸序列的子序列，具有至少100个核苷酸；（g) -种序列，该序 列由于遗传密码的简并性而简并为一种序列，该序列如在（a)、（b)、（c)、（d)、（e)、或（f)中 任一项所定义的；和（h)根据（a)、（b)、（c)、（d)、（e)、（f)或（g)的核苷酸序列的互补链。 在第三方面，本专利技术涉及一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体 包括第二方面的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接至指导该多肽在一个表达宿主内的产 生的一个或多个控制序列。 在第四方面，本专利技术涉及一种重组宿主细胞，该重组宿主细胞包括第二方面的多 核苷酸，该本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有磷脂酶A活性的分离的多肽，该分离的多肽选自下组，该组由以下各项组成：(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽或SEQ ID NO:3的多肽具有至少80％的序列一致性；(b)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸在高严格条件下与(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其cDNA序列、或(ii)(i)的全长互补体杂交；(c)一种多肽，该多肽由一种多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或与其cDNA序列具有至少65％序列一致性；(d)SEQ ID NO:2的成熟多肽的或SEQ ID NO:3的多肽的一种变体，该变体在在一个或多个位置处包括取代、缺失、和/或插入；和(e)(a)、(b)、(c)、或(d)的多肽的一个片段，该片段具有磷脂酶A活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：K·博克，S·兰德维克，M·L·达姆斯特里普，J·布拉斯克，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK