一种基于PCT/IP-10免疫层析的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种基于PCT/IP

【技术实现步骤摘要】
一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒及其制备方法


[0001]本专利技术属于免疫学
，更具体地说，涉及一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒；尤其涉及一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒的制备方法。

技术介绍

[0002]降钙素原(Procalcitonin，PCT)是降钙素前体，为一种无激素活性的糖蛋白，由11号染色体上CALC
‑
I基因编码及转录后，在甲状旁腺C细胞粗面内质网翻译成PCT前体，进入内质网进行糖基化，去除N
‑
端信号肽后，形成116氨基酸的PCT，分子量约为13kD。
[0003]PCT作为一种内源性非类固醇类抗炎物质，当发生细菌感染和脓毒症时，诱导甲状旁腺C细胞产生大量PCT进入血循环，血液中PCT水平迅速升高，2小时即可升高，6小时急剧上升，8
‑
24小时达高峰。健康人群血浆PCT浓度低于0.1ng/ml。细菌感染患者PCT诊断临界值为0.5ng/ml，败血症发生时，PCT诊断临界值为1.0ng/ml，严重脓毒症和脓毒性休克患者PCT浓度波动在5
‑
500ng/ml之间。可见，检测血液中PCT水平作为诊断细菌感染的早期标志物，也是判定系统性炎性反应综合征(SIRS)、脓毒症、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)等疾病发生的重要指标。研究发现，病毒感染和非感染性炎症刺激，如自身免疫性疾病和慢性炎性过程，可小幅升高血清中PCT水平，很少超过0.5ng/ml；在创伤、烧伤、缺血再灌注、胰腺炎或重大手术后，损伤组织细胞，引发细胞因子风暴反应，明显提高血液中PCT水平，可见血液中PCT水平无法鉴别感染或非感染因素引发宿主炎症反应，需要检测其他指标辅助诊断败血症的发生。干扰素γ诱导蛋白10(Interferon
‑
gammainducibleprotein10，IP
‑
10)又称为CXCL10，由IFN
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γ，TNF或细菌脂多糖(LPS)诱导多种细胞，包括成纤维细胞、内皮细胞、角蛋白细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞产生IP
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10。IP
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10能特异性与趋化因子受体CXCR3结合发挥作用，促进CXCR3+细胞的趋化调节、诱导细胞凋亡、调节细胞生长和增殖以及抑制血管生成。
[0004]研究发现，细菌，病毒或真菌感染诱导宿主炎症反应并诱导机体细胞产生高水平IP
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10。检测发现，正常人组血清中IP
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10水平小于0.2ng/ml，细菌感染患者组血清中IP
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10临界值为0.6ng/ml，病毒感染患者组血清中IP
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10临界值为1.9ng/ml。又有研究发现，鼻病毒、呼吸道合胞病毒、乙型和丙型肝炎病毒以及流感病毒感染，诱导机体细胞产生高水平IP
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10，此外，血清中IP
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10水平可用于指导丙型肝炎患者治疗预后的标记物，因此，检测血液中IP
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10水平成为诊断病毒感染的生物标志物。
[0005]在组织损伤、重大手术后或非感染性炎症状态下，血清中IP
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10水平升高不明显，检测IP
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10水平可用于鉴别出感染性炎症和非感染性炎症反应。细菌感染发生时诱发甲状旁腺器官产生大量PCT，而病毒感染发生时主要诱导淋巴细胞或成纤维细胞产生大量IP
‑
10；非感染性炎症发生时可诱发宿主产生高水平PCT，但对IP
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10作用不明显，由此可见，同时检测血液中PCT和IP
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10水平，能特异性鉴定出细菌性感染或病毒性感染发生，能区别开感染性炎症和非感染性炎症反应，需要开发同时检测血液中PCT和IP
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10水平的试剂盒。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒及其制备方法，操作简单，快速，特异性高，定量测定出血液或其他体液中PCT和IP
‑
10浓度，能满足临床检验要求。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0008]一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒，包括免疫层析检测卡，样品液和PCT/IP
‑
10质控品，所述免疫层析检测卡包括免疫层析试纸条和外壳，所述免疫层析试纸条包括PVC底板以及PVC底板上顺序连接固定Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水纸，Fusion5用于吸附PCT抗体
‑
微球，IP
‑
10抗体
‑
微球和IgG
‑
微球；硝酸纤维素膜固定PCT抗体形成检测线(T1线)，固定IP
‑
10抗体形成检测线(T2线)和固定抗IgG抗体形成质控线(C线)；
[0009]所述PCT/IP
‑
10质控品包括冻干1
‑
2ng/mlPCT蛋白和2
‑
4ng/mlIP
‑
10蛋白和0.5
‑
1.0ml蛋白稀释液。
[0010]其中，所述的微球为金标微球、彩色微球、荧光微球、磁性微球或上转换发光微球中的一种或者多种；所述微球表面修饰官能团为氨基、羧基或羟基中的一种，所述微球直径范围是100
‑
300nm。
[0011]本专利技术还提供一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0012]S1、制备PCT抗体
‑
荧光微球；
[0013]S2、制备IP
‑
10抗体
‑
荧光微球；
[0014]S3、制备IgG
‑
荧光微球；
[0015]S4、喷涂Fusion5和硝酸纤维素膜；
[0016]S5、组装免疫层析检测卡；
[0017]S6、制备样品液和PCT/IP
‑
10质控品。
[0018]其中，把PCT单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：
[0019]A、10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
[0020]B、再加1.2ml20mMMES缓冲液，PH6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
[0021]C、加0.2ml上述MES缓冲液含5mMEDC和20mMSulfo
‑
NHS到离心管中，混均，室温，反应30分钟；
[0022]D、再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中，离心，15本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒，其特征在于，包括免疫层析检测卡，样品液和PCT/IP
‑
10质控品，所述免疫层析检测卡包括免疫层析试纸条和外壳，所述免疫层析试纸条包括PVC底板以及PVC底板上顺序连接固定Fusion5、硝酸纤维素膜和吸水纸，Fusion5用于吸附PCT抗体
‑
微球，IP
‑
10抗体
‑
微球和IgG
‑
微球；硝酸纤维素膜固定PCT抗体形成检测线(T1线)，固定IP
‑
10抗体形成检测线(T2线)和固定抗IgG抗体形成质控线(C线)；所述PCT/IP
‑
10质控品包括冻干1
‑
2ng/ml PCT蛋白和2
‑
4ng/ml IP
‑
10蛋白和0.5
‑
1.0ml蛋白稀释液。2.根据权利要求1所述的一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒，其特征在于：所述的微球为金标微球、彩色微球、荧光微球、磁性微球或上转换发光微球中的一种或者多种；所述微球表面修饰官能团为氨基、羧基或羟基中的一种，所述微球直径范围是100
‑
300nm。3.一种根据权利要求1
‑
2所述的基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、制备PCT抗体
‑
荧光微球；S2、制备IP
‑
10抗体
‑
荧光微球；S3、制备IgG
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荧光微球；S4、喷涂Fusion5和硝酸纤维素膜；S5、组装免疫层析检测卡；S6、制备样品液和PCT/IP
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10质控品。4.一种根据权利要求3所述的基于PCT/IP
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10免疫层析的试剂盒的制备方法，其特征在于：把PCT单克隆抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：A、10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；B、再加1.2ml20mMMES缓冲液，PH6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；C、加0.2ml上述MES缓冲液含5mMEDC和20mMSulfo
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NHS到离心管中，混均，室温，反应30分钟；D、再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；E、加0.2mlPH7.0PBS含40ugPCT单克隆抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；F、加40ul100mMTris，PH7.4到离心管中，室温，反应60分钟；G、加1.2mlNaHPO4缓冲液，20mMNaHPO4，PH7.0，0.2％BSA，0.01％Tween
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20到离心管中；H、离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；I、用上述NaHPO4缓冲液悬浮PCT抗体
‑
荧光微球，2
‑
8℃储存，备用。5.根据权利要求3所述的一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒的制备方法，其特征在于：把兔IP
‑
10
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C抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球上，微球直径为200nm，步骤如下：A、10mg/ml铕螯合物荧光标记羧基修饰微球，取0.1ml加入1.5ml离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；
B、再加1.2ml20mMMES缓冲液，PH6.0，到离心管中悬浮微球，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；C、加0.2ml上述MES缓冲液含5mMEDC和10mMSulfo
‑
NHS到离心管中，混均，室温，反应30分钟；D、再加1.2ml上述MES缓冲液到离心管中，离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；E、加0.2mlPH7.0PBS含35ug兔IP
‑
10
‑
C抗体到上述离心管中，室温，反应2小时；F、加40ul100mMTris，PH7.4到离心管中，室温，反应60分钟；G、加1.2mlNaHPO4缓冲液，20mMNaHPO4，PH7.0，0.2％BSA，0.01％Tween
‑
20到离心管中；H、离心，15000rpm，15分钟，去除上清液；I、用上述NaHPO4缓冲液悬浮IP
‑
10抗体
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荧光微球，2
‑
8℃储存，备用。6.根据权利要求3所述的一种基于PCT/IP
‑
10免疫层析的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述硝酸纤维素膜上T1线，T2线和C线的制备过程为：用磷酸盐缓冲液稀释PCT抗体浓度到0.5
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2.5mg/ml，IP
‑
1抗体浓度到0.5
‑
2.5mg/m和IgG抗体浓度到0.1
‑
1.0mg/ml；用0.2
‑
1.0ul/cm速度将上述抗体液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T1线、T2线和C线，间隔为4
‑
6mm，25
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张蕾，常虹，关恒，张金玲，孙彧峰，丁书博，林琳，牛公正，
申请(专利权)人：长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：