一种基于IP-10抗原表位肽-载体蛋白抗原的IP-10体外诊断试剂盒制备方法技术

本发明专利技术提供一种基于IP

【技术实现步骤摘要】
一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法


[0001]本专利技术属于免疫学
，更具体地说，涉及一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法。

技术介绍

[0002]干扰素γ诱导蛋白
‑
10(Interferon
‑
gamma inducible、protein，IP
‑
10)也称为CXC趋化因子10(CXCL10)，属于非谷氨酸
‑
亮氨酸
‑
精氨酸CXC类趋化因子家族成员之一。
[0003]IP
‑
10基因定位于染色体4q21，含有3个内含子和4个外显子，成熟IP
‑
10含有77个氨基酸残基，分质量为10kD，其一级氨基酸序列中含有4个保守半胱氨酸残基，形成2个内部二硫键的蛋白。IP
‑
10主要来源为成纤维细胞、单核细胞、巨噬细胞及T淋巴细。IP
‑
10结合受体为CXCR3，存在T淋巴细胞(Th1)、天然杀伤症(NK)细胞和嗜酸性细胞表面，与其他化学趋化因子不同，IP
‑
10对嗜中性粒细胞没有趋化活性，可激活T细胞和单核细胞，还可刺激NK细胞和T细胞迁移，调节T细胞成熟和粘附分子表达，也可抑制骨髓群的形成和血管生成作用。
[0004]研究发现，病毒、细菌、真菌或寄生虫感染人体后，引发机体内IP
‑
10水平升高。有研究检测新生儿血清中IP
‑
10水平，发现在1小时内，新生儿感染组血清中IP
‑
10水平明显高于未感染组，在24小时内，血清中IP
‑
10水平达高峰。当血清中IP
‑
10浓度>1250pg/mL，诊断新生儿败血症，其灵敏度为93％，特异性为89％。可见，检测血液中的IP
‑
10水平，可用于早期诊断感染性疾病的发生，需要开发简单，快速及定量检测IP
‑
10试剂盒。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，本专利技术制备IP
‑
10抗体并建立检测IP
‑
10免疫层析试剂盒，特异，快速及定量检测血液或其他体液中IP
‑
10浓度，用于诊断感染性疾病或败血症的发生。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0007]一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，包括如下步骤：
[0008]S1、合成IP
‑
10肽，所述合成IP
‑
10肽的具体步骤包括：
[0009]A、合成IP
‑
10抗原表位肽；
[0010]B、合成IP
‑
10校准品肽；
[0011]C、合成IP
‑
10连接肽；
[0012]S2、制备IP
‑
10
‑
N抗体，所述制备IP
‑
10
‑
N抗体的具体步骤包括：
[0013]H、IP
‑
10
‑
N抗原表位肽偶联载体蛋白；
[0014]I、制备IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原；
[0015]J、IP
‑
10
‑
N抗原免疫动物；
[0016]K、检测IP
‑
10
‑
N抗血清滴度；
[0017]L、制备IP
‑
10
‑
亲合层析琼脂糖；
[0018]M、纯化IP
‑
10
‑
N抗体；
[0019]N、测定IP
‑
10
‑
N抗体亲和力及特异性；
[0020]S3、制备IP
‑
10
‑
C抗体；
[0021]S4、制备检测IP
‑
10荧光免疫层析试剂盒：
[0022]D、IP
‑
10
‑
C抗体偶联荧光微球；
[0023]E、喷涂Fusion5和硝酸纤维素膜；
[0024]F、制备免疫层析检测卡。
[0025]其中，所述IP
‑
10
‑
N抗原表位肽偶联载体蛋白，包括以下步骤：
[0026](1).KLH载体蛋白液：5mg Maleimide活化KLH载体(ActiveHOOK KLH)，溶解在1.0ml ddH2O中；
[0027](2).IP
‑
10
‑
N抗原表位肽液:5mg合成IP
‑
10
‑
N抗原表位肽，纯度>90％，溶解在1.0mlPBSPH7.4；
[0028](3).KLH载体蛋白液与IP
‑
10
‑
N抗原表位肽液混合，室温，摇动2小时；
[0029](4).将上述反应液放入MWCO 12K蛋白透析膜袋中，用PBSPH7.4透析，2
‑
8℃，过夜；
[0030](5).获得上述含IP
‑
10
‑
N
‑
KLH透析液，测定IP
‑
10
‑
N
‑
KLH浓度，
‑
80℃冻存；
[0031]其中，制备所述IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原时，PBSPH7.4调节IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原浓度到1.0mg/ml，用0.22um微孔滤膜，过滤除菌，IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原与福氏完全佐剂(1：1)混合，形成抗原A；IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原与福氏不完全佐剂(1：1)混合，形成抗原B。
[0032]其中，所述IP
‑
10
‑
N抗原免疫动物，包括以下步骤：
[0033]选用6
‑
10月的Boer本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、合成IP
‑
10肽，所述合成IP
‑
10肽的具体步骤包括：A、合成IP
‑
10抗原表位肽；B、合成IP
‑
10校准品肽；C、合成IP
‑
10连接肽；S2、制备IP
‑
10
‑
N抗体，所述制备IP
‑
10
‑
N抗体的具体步骤包括：A、IP
‑
10
‑
N抗原表位肽偶联载体蛋白；B、制备IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原；C、IP
‑
10
‑
N抗原免疫动物；D、检测IP
‑
10
‑
N抗血清滴度；E、制备IP
‑
10
‑
亲合层析琼脂糖；F、纯化IP
‑
10
‑
N抗体；G、测定IP
‑
10
‑
N抗体亲和力及特异性；S3、制备IP
‑
10
‑
C抗体；S4、制备检测IP
‑
10荧光免疫层析试剂盒：A、IP
‑
10
‑
C抗体偶联荧光微球；B、喷涂Fusion5和硝酸纤维素膜；C、制备免疫层析检测卡。2.根据权利要求1所述的一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，其特征在于：所述IP
‑
10
‑
N抗原表位肽偶联载体蛋白，包括以下步骤：(1).KLH载体蛋白液：5mg Maleimide活化KLH载体(ActiveHOOK KLH)，溶解在1.0ml ddH2O中；(2).IP
‑
10
‑
N抗原表位肽液:5mg合成IP
‑
10
‑
N抗原表位肽，纯度>90％，溶解在1.0mlPBSPH7.4；(3).KLH载体蛋白液与IP
‑
10
‑
N抗原表位肽液混合，室温，摇动2小时；(4).将上述反应液放入MWCO 12K蛋白透析膜袋中，用PBSPH7.4透析，2
‑
8℃，过夜；(5).获得上述含IP
‑
10
‑
N
‑
KLH透析液，测定IP
‑
10
‑
N
‑
KLH浓度，
‑
80℃冻存。3.根据权利要求1所述的一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，其特征在于：制备所述IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原时，PBSPH7.4调节IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原浓度到1.0mg/ml，用0.22um微孔滤膜，过滤除菌，IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原与福氏完全佐剂(1：1)混合，形成抗原A；IP
‑
10
‑
N
‑
KLH抗原与福氏不完全佐剂(1：1)混合，形成抗原B。4.根据权利要求1所述的一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，其特征在于：所述IP
‑
10
‑
N抗原免疫动物，包括以下步骤：选用6
‑
10月的Boer公山羊：Day 1:1.6ml抗原A，注射到山羊皮下，40点注射(40ul/每点)；Day 14：0.8抗原B，注射到山羊皮下，20点注射(40ul/每点)；Day 28：加强注射抗原B一次；Day 42：加强注射抗原B一次；
Day 49：采集山羊血液200ml，测定IP
‑
10
‑
N抗血清滴度；Day 56：加强注射抗原B一次；Day 63：采集山羊血液，终止实验。5.根据权利要求1所述的一种基于IP
‑
10抗原表位肽
‑
载体蛋白抗原的IP
‑
10体外诊断试剂盒制备方法，其特征在于：所述检测IP
‑
10
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N抗血清滴度，步骤如下：用50mM PH9.6碳酸盐缓冲液制备10ug/mlIP
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10校准品肽包被液，10ug/mlBSA包被液，加100ul包被液到酶联反应板孔中，2
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8℃，过夜去；去除包被液，加100ul封闭液，PBSPH7.4，1.0％BSA到酶联反应板孔中，室温，4小时，去除封闭液；用PBS
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T，含0.05％Tween20洗涤2次；制备0，10，100，1000倍稀释IP
‑
10
‑
N抗血清，100ul稀释抗血清加到酶联反应板孔中，室温，反应1小时，去除反应液，用PBS
‑
T洗涤5次；1：4000抗羊IgG抗体
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【专利技术属性】
技术研发人员：王晓慧，孙彧峰，关恒，张金玲，丁书博，林琳，牛公正，
申请(专利权)人：长春恒晓生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：