一种氧氟沙星检测方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种氧氟沙星检测方法及试剂盒，包含以下步骤，A、样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解；B、氧氟沙星的测定：将步骤A得到的样品通过检测试剂盒进行测定。本发明专利技术的氧氟沙星检测方法及检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。能够在动物性食品(如水产品、动物组织、蜂蜜)中的氧氟沙星药物残留检测中发挥重要作用。

Ofloxacin detection method and reagent kit

The invention discloses a ofloxacin detection method and kit, which comprises the following steps: A, sample processing, the sample pretreatment, adding extraction agent after homogenate homogenate after ultrasonic extraction, after the first centrifugation to obtain supernatant, with nitrogen residue to obtain supernatant after drying with the initial mobile phase dissolution; Determination of B and ofloxacin: step A samples obtained were determined by detection kit. The ofloxacin detection method and the detection kit of the invention have the characteristics of high sensitivity, simplicity, speed and accuracy. Compared with the traditional colorimetric ELISA method, the sensitivity can be improved by an order of magnitude. It can play an important role in the detection of ofloxacin residues in animal products (such as aquatic products, animal tissues, honey).

【技术实现步骤摘要】
一种氧氟沙星检测方法及试剂盒
本专利技术涉及一种检测技术，具体是一种氧氟沙星检测方法及试剂盒。
技术介绍
氧氟沙星是一种广谱高效抗菌药物，在临床上的应用相当广泛。氧氟沙星抗生素对大多数革兰氏阳性菌、大肠杆菌、绿脓杆菌有非常好的抑制活性;对葡萄球菌、衣原体、分支杆菌、支原体和尿属支原体有中等强度的抑制活性;对链球菌(尤其是D族链球菌)、肠球菌及厌氧菌有很小或无抑制活性。随着该类药物的广泛应用及深入研究，有关氧氟沙星药物的不良反应和耐药性报道越来越多，其潜在的严重不良反应逐渐受到人们的重视，作为兽药和饲料添加剂而大量的用于动物，因而其残留在动物可食性产品中的可能性相对很大。这些残留物可直接对人造成危害外，更严重的是低浓度的残留药物可能对氧氟沙星药物敏感的致病菌产生耐药性，从而间接危害人类健康。为保护人类健康，控制氧氟沙星抗生素的残留，美国FDA规定沙星类在食物中的残留量小于100卿比，我国规定的氟诺哇酮在牛奶中的残留量应小于1OO}g/kg。因此，需要寻求简便、快速、准确检测乳与乳制品中氧氟沙星抗生素残留量的检测方法，才能满足日趋严格的残留限量要求，从而保证人们饮用牛奶的卫生和安全。检测氧氟沙星残留量的方法有微生物法、高效液相色谱法、液相色谱一质谱法、免疫分析法、高效毛细管区带电泳法和化学发光分析法等。目前，牛奶中氧氟沙星抗生素常用的检测方法主要是高效液相色谱法。但采用此法，检测时间较长，而且高效液相色谱法检测氧氟沙星抗生素的检出限较高。目前，对氧氟沙星的检测主要在食品领域以及环境领域，用于抗生素检测的方法主要有高效液相色谱技术、微生物法、免疫分析法，这些方法需要昂贵的检测仪器或专业的检测人员，不适合家庭使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种氧氟沙星检测方法及试剂盒，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种氧氟沙星检测方法，包含以下步骤，A、样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；B、氧氟沙星的测定：将步骤A得到的样品通过检测试剂盒进行测定。作为本专利技术进一步的方案：所述检测试剂盒包括盒体以及设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有以氧氟沙星衍生物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：喹诺酮类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。作为本专利技术进一步的方案：所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。作为本专利技术再进一步的方案：所述包被抗原浓度为20μg/mL。作为本专利技术再进一步的方案：所述喹诺酮类的单克隆抗体是由氧氟沙星衍生物与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。作为本专利技术再进一步的方案：所述喹诺酮类系列标准溶液浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL。作为本专利技术再进一步的方案：所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH2PO4·2H2O5.74g、Na2HPO4·12H2O32.6g的水溶液。作为本专利技术再进一步的方案：所述浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。作为本专利技术再进一步的方案：所述化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液，所述百分比为质量百分比。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术的氧氟沙星检测方法及检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，与传统的比色ELISA法比较，灵敏度可以提高一个数量级。能够在动物性食品(如水产品、动物组织、蜂蜜)中的氧氟沙星药物残留检测中发挥重要作用。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。一种氧氟沙星检测方法，包含以下步骤，A、样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；B、氧氟沙星的测定：将步骤A得到的样品通过检测试剂盒进行测定。所述检测试剂盒包括盒体以及设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有以氧氟沙星衍生物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：喹诺酮类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。包被抗原浓度为20μg/mL。喹诺酮类的单克隆抗体是由氧氟沙星衍生物与牛血清蛋白偶合制成的偶联物作为免疫原免疫Balb/c小鼠制备获得。喹诺酮类系列标准溶液浓度分别为：0ng/mL，0.1ng/mL，0.3ng/mL，0.9ng/mL，2.7ng/mL和8.1ng/mL。浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaH2PO4·2H2O5.74g、Na2HPO4·12H2O32.6g的水溶液。浓缩洗涤溶液是含有体积分数0.05％吐温-20的pH＝7.4，0.1mol/L磷酸盐缓冲液。化学发光液A液为鲁米诺含量为0.01M、对甲苯酚含量为0.001MpH＝8.8的三(羟甲基)氨基甲烷溶液；B液为100mL溶液含柠檬酸2.1g，无水Na2HPO42.82g，0.75％的过氧化氢脲0.64mL的溶液，所述百分比为质量百分比。本专利技术的工作原理是：氧氟沙星衍生物合成：A，将氧氟沙星1mmol，溶于15mL三氯甲烷中，加入DCC2mmol，DMAP催化量，氨基丙酸叔丁酯1.5mmol，室温搅拌5h，TLC监测原料消失，过滤，将液相水洗，无水NaS2O4干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/5)。B，将上述产物溶于冰醋酸中，室温搅拌2h，TLC监测原料消失，减压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于1mol/LNaOH溶液，调节pH3～5，乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/1)，得喹诺酮类半抗原。(2)免疫原的合成：A，A液制备：取15mg氧氟沙星半抗原，溶解于1mLDMF中，取15EDC用0.2ml水充分溶解后于加入溶解有半抗原的DMF中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。B，BSA偶联：称取BSA40mg，使之充分溶解在3mLPBS(PH7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，C，透析：用0.01mol/lPBS4度透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。称取半抗原20mg和OVA30mg，按上述步骤反应，包被抗原，供包被用。样品前处理：用均质器均质组织样本，称取2.0±0.05g均质物至50mL聚苯乙烯离心管中，—加入0本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种氧氟沙星检测方法，其特征在于，包含以下步骤，A、样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC‑MS/MS测定；B、氧氟沙星的测定：将步骤A得到的样品通过检测试剂盒进行测定。

【技术特征摘要】
1.一种氧氟沙星检测方法，其特征在于，包含以下步骤，A、样品的处理：将待测样品进行前处理，加入提取剂后进行匀浆，匀浆之后进行超声提取，之后进行第一次离心分离得到上清液，用氮气将上清液吹干后得到的残余物用初始流动相溶解，混匀，之后进行第二次离心分离得到上清液，取上清液进行微孔滤膜过滤得到的滤液用于UPLC-MS/MS测定；B、氧氟沙星的测定：将步骤A得到的样品通过检测试剂盒进行测定。2.一种氧氟沙星检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括盒体以及设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂，所述酶标板的各孔包被有以氧氟沙星衍生物与卵清蛋白偶联制成的包被抗原；所述试剂包括：喹诺酮类单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、喹诺酮类系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液。3.根据权利要求2所述的一种氧氟沙星检测方法及试剂盒，其特征在于，所述酶标板为乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板。4.根据权利要求3所述的一种氧氟沙星检测方法及试剂盒，其特征在于，所述包被抗原浓度为20μg/mL。5.根据权利要求2所述的一种氧氟沙星检测方法及试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：周合，张根义，张进，周朱晨，杨敏，胡彬，吴念绮，
申请(专利权)人：百奥森江苏食品安全科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32