桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。本发明专利技术揭示了一种可特异性鉴定桉树成分的引物，所述引物针对含有桉树成分的DNA可发生特异性扩增，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增。本发明专利技术还提供了一种简化的PCR检测方法，所述的方法可良好地应用于鉴定桉树成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。

【技术实现步骤摘要】
桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒
本专利技术属于PCR检测领域，更具体地，本专利技术涉及桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。
技术介绍
蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物混合后，经充分酿造而成的天然甜物质。每年全世界的蜂蜜总产量大概有130万吨，产量分布情况如下：欧洲占23％，北美洲占16％，南美洲占10％，亚洲占37％，还有大洋洲占2％。而中国是世界上最大的蜂蜜生产和出口国，每年蜂蜜总产量在30～40万吨之间，总年产值也在80亿人民币左右。2013年中国蜂产品协会统计数据显示，中国近年来蜂蜜年出口保持在10万吨左右，2012年出口达到了11万吨，占世界蜂蜜贸易总量的1/4，出口量世界第一。由于蜂蜜市场需求旺盛，产量难以满足国内外市场需要，为了获得更高的市场份额，在经济利益的驱动下，部分蜂蜜生产企业利用蜂蜜市场监管不足、检测技术薄弱、消费者难以识别等弱点，大量生产制造假蜂蜜，投入市场，牟取暴利。据统计，掺假占据了蜂蜜市场的20％～30％。蜂蜜掺假的方式主要有两种，一种是以假乱真，即加入其它价格低廉的甜味物质，例如糖和工业糖浆，来提高蜂蜜的产量。有些不法厂家为了改善掺假蜂蜜的外观品质，甚至还掺入焦糖色素、合成色素等。蜂蜜香精的出现更使得假蜂蜜几乎可以乱真。另一种掺假方法就是以次充好，包括用价格低廉的杂花蜜充当价格相对较高的单一花种蜂蜜，用价格相对低廉的单花种蜂蜜掺入高价单花种蜂蜜。从某种意义上虽然没有掺入外源的糖分造成蜂产品伪劣，但在一定程度上也存在假冒问题，消费者权益受到侵害。此外，欧美国家对于蜂蜜进口质量要求比国内严格，检测指标较多，由于我国蜂蜜质量情况良莠不齐，蜂蜜出口贸易受到极大限制。且蜂蜜掺假行为严重损害了消费者利益，损坏了我国天然蜂蜜的产品信誉，阻碍了中国蜂业的健康发展。随着蜂蜜掺假的水平的不断提高，蜂蜜的真伪评价难度加大。传统的检测方法已经不能满足生产实践和应用中的需求。现代分析技术在蜂蜜掺假识别虽具有很大优势及发展空间，但价格昂贵，且由于不同蜂蜜品种自身的复杂性，千差万别的来源产地，以及受采收季节、储存、加工等因素影响，使得检测带有很大的不确定性，而且不能有效区分混合蜂蜜和单一蜜，及低价蜜掺杂高价蜜。且目前更多的技术处在实验室研究阶段，实用性不高、不能全方面的推广。因此，亟需建立快速、准确、易推广的蜂蜜身份鉴定方法，用于对蜂蜜的真伪及种类进行准确区分，以完善现有的管理体系。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供桉树成分实时荧光PCR检测方法及其试剂盒。在本专利技术的第一方面，提供一种鉴定桉树成分的方法，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。在一个优选例中，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。在另一优选例中，以ndhB基因作为检测内参，检测ndhB基因的引物如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在另一优选例中，以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物以及SEQIDNO:7所述的Taqman探针进行ndhB基因的实时荧光PCR检测。在另一优选例中，所述的待测样品是食品、饮料、植物、植物制品(如植物精油等)。在本专利技术的另一方面，提供一种用于鉴定桉树成分的引物，所述引物是引物对，其序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在本专利技术的另一方面，提供一种用于鉴定桉树成分的Taqman探针，所述的探针序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。在本专利技术的另一方面，提供所述的引物和所述的Taqman探针的用途，用于从待测样品中鉴定桉树成分。在本专利技术的另一方面，提供一种鉴定桉树成分的试剂盒，其中包括前面所述的引物和前面所述的Taqman探针。在一个优选例中，所述试剂盒中还包括：检测ndhB基因的引物，其序列如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自以下的试剂：DNA提取试剂，Taq酶，PCR缓冲液，DNA聚合酶，和/或说明鉴定桉树成分的方法的使用说明书。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、内参照实时荧光PCR通用性检测。其中，48种显花植物样品DNA显示特异性的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。图2、桉树引物探针实时荧光PCR。其中，7个桉树品种样品DNA显示特异性的扩增曲线，其它DNA样品及空白对照无特异性扩增曲线。图3、柠檬桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。图4、直干桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。图5、蓝桉引物探针实时荧光PCR扩增反应及其标准曲线。其中，上述为扩增曲线，下图为标准曲线。图6、柠檬桉成分最低检测限检测结果。其中，基线上方为1％桉树蜜/油菜蜜DNA的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。图7、蓝桉成分最低检测限检测结果。其中，基线上方为1％桉树蜜/油菜蜜DNA的扩增曲线，阴性对照及空白对照无特异性的扩增曲线。图8、市售蜂蜜中桉树成分检测结果。其中，图中标号表示各市售样品的编号，1为荔枝和荆条混合蜜，2为荆条蜜，3为油菜和向日葵混合蜜，4为洋槐和龙眼混合蜜，5为紫云英和向日葵混合蜜，6为洋槐蜜，7为桉树蜜，8为桉树蜜。具体实施方式本专利技术人经过广泛而深入的研究和试验，首次揭示一种可特异性鉴定桉树成分的引物，所述引物针对含有桉树成分的DNA可发生特异性扩增(获得阳性结果)，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增(获得阴性结果)。为了简化PCR扩增方法，本专利技术人还设计了配合所述引物的、用于进行实时荧光PCR的Taqman探针。采用所述的引物配合Taqman探针，可良好地应用于鉴定桉树成分，并且具有良好的再现性、灵敏度。如本文所用，所述的“桉树成分”是指特异性来自于桉树的成分，可以是桉树本身或其加工产品，包括蜂蜜等。桉树(EucalyptusrobustaSmith)又称尤加利树，是桃金娘科桉属植物的统称。桉树蜜的蜜源主要是大叶桉、小叶桉、和柠檬桉等。桉树蜜有养胃补虚、清热、补中、解毒、润燥的功效，还有一定的镇定作用，营养价值较高。鉴于目前蜂蜜鱼龙混杂的状况，需要以有效的手段来区分真正来自于桉树作为蜜源的蜂蜜。引物和探针本专利技术人通过桉树及其它物种在基因层面的比较和筛选，获得一种可特异性鉴定桉树成分的引物，其对于桉树的DNA发生特异性扩增，而对没有桉树成分的DNA不发生特异性扩增。因此，本专利技术提供一种引物，所述的引物具SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。本专利技术的这些引物还可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。本专利技术还提供一种探针，所述的探针是具有SEQIDNO:3所示的核苷酸序列和具有SEQIDNO:4所示的核苷酸序列的两条探针；较佳地，所述的探针是Taqman探针，从而便于实时荧光检测。检测内参本专利技术人经过反复筛选，还获得了一组适用于作为内参的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定桉树成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定桉树成分的方法，其特征在于，所述方法包括：以待测样品的DNA为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物进行PCR扩增；若发生特异性扩增，则表明待测样品中包含桉树成分。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示的引物以及SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示的Taqman探针进行实时荧光PCR检测。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，以ndhB基因作为检测内参，检测ndhB基因的引物如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，以SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示的引物以及SEQIDNO:7所述的Taqman探针进行ndhB基因的实时荧光PCR检测。5.如权利要求1所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：李想，李辉，高琴，刘博，任怡菲，门光琦，
申请(专利权)人：中华人民共和国上海出入境检验检疫局，上海辉睿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31