荧光素酶分析方法、试剂和试剂盒技术

本发明专利技术涉及用生物发光检测酶活性的方法、试剂和试剂盒。特别涉及一种新的荧光素酶分析系统，其具有降低的背景发光，能提高检测灵敏度。本发明专利技术提供了一种用腔肠素或其类似物作为底物检测样品中荧光素酶活性的方法，其包括：（ａ）通过使所述样品与荧光素酶检测试剂接触而启动荧光素酶催化发光，得到反应混合物，所述试剂包括腔肠素和至少一种其量足以减少所述腔肠素的自发光的碘化物源，（ｂ）在适于发光的条件下培养所述试剂混合物，和（ｃ）测定产生的光。本发明专利技术还提供该方法中所用的检测试剂和试剂盒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用生物发光检测酶活性的方法、试剂和试剂盒。特别涉及一种新的荧 光素酶分析系统，其具有降低的本底发光，从而增加检测的灵敏度。
技术介绍
荧光素酶是通常在分析细胞中分子活动时用作指示剂的一种酶。当用作指示剂 时，特定的细胞活动或条件会指示出细胞中荧光素酶的量。因此，开发了许多检测技术来测 定生物样品中含有的荧光素酶的量。这些检测技术通常包括通过测定荧光素酶的酶活来 评估样品中出现的荧光素酶的量；而荧光素酶的酶活是通过破坏荧光素酶的酶反应底物或 制得相应的反应产物体现的。荧光素酶可以与合适的底物反应发光，其也是反应产物之一。 上述发光反应产生的光量可以测定并用来确定样品中荧光素酶的存在或含量。用腔肠素(coelenterazine)作为底物发光的荧光素酶包括=Renilla, Gaussia, Metridia和Obelia。这些荧光素酶催化腔肠素(coelenterazine)氧化产生 coelenteramide、CO2禾口光。该反应如下所示 众所周知，腔肠素在缺少荧光素酶时也能被氧化并发光。以这种方式产生的光被 称为自发光。自发光产生了本底信号，并因此降低了荧光素酶检测分析的灵敏度。特别是， 腔肠素的自发光会降低微量荧光素酶的检测能力，例如当自发光信号与由荧光素酶产生的 发光信号有相似的量级时。某些分析成分会增加不期望的腔肠素自发光的产生，其包括检测样品的成分和期 望分析的成分，例如洗涤剂和蛋白质。例如，非离子型洗涤剂就常被用做细胞溶解剂来使荧 光素酶增溶并使底物容易进入，而蛋白质则通常存在于被测样品中(如细胞，添加了血清 的细胞培养基)。因此，在许多期望的分析条件下，腔肠素自发光会降低荧光素酶分析的灵 敏度。
技术实现思路
因此，本专利技术的目的是降低该不希望的腔肠素自发光，从而提高荧光素酶检测分 析的灵敏度并使更少量的荧光素酶可被检测。如本文所述，减少腔肠素自发光及其其类似 物的条件已经确定。具体而言，已观察到向荧光反应混合物中添加碘化物可以显著降低腔肠素的自发光。因此，本专利技术涉及一种用腔肠素(coelenterazine)或其类似物作为底物，检测样品中荧光素酶活性的方法，其包括(a)通过将所述样品与荧光素酶检测试剂接触启动荧 光素酶催化发光，产生反应混合物，所述的试剂包括腔肠素(coelenterazine)和至少一种 其量足以降低所述腔肠素自发光的碘化物源，(b)在适于发光的条件下培养所述的试剂混 合物，和(c)测定发出的光。本文中使用的术语“碘化物源”是指任何能够在水溶液中提供碘离子的化合物。 碘离子是具有-1电荷的碘原子。具有氧化态-1的碘的化合物因此被称为碘化物。其包括 离子化合物，例如碘盐。考虑到与分析条件的相容性，优选使用在水性条件下能溶解的碘化 物源。除了黄色的碘化银和黄色的碘化铅，大多数离子碘化物都是可溶的。一个碘化合物 的试验是，通过加入几滴酸酸化水性化合物，以去除存在的任何碳酸盐离子，然后加入硝酸 铅，产生嫩黄色的碘化铅沉淀。具体的碘化物源由使用者选择，并可在考虑下列因素的基础 上选择溶解性、毒性、碘化盐的可获得性。示例性的碘化物源包括碘化物盐，如NaI、KI、LiI、NH4I及类似物，和它们之间的任 意组合。实施本专利技术也可使用那些在溶液中会在一定程度上分离并产生游离碘的碘化合物。如下面的实施例中所示，当包括腔肠素的荧光素酶反应混合物还包括至少一种碘 化物源时，腔肠素及其类似物的自发光显著降低。据观察碘化物降低腔肠素及其类似物的自发光的能力与检测到得荧光素酶的类 型无关，因此，当检测Renilla和Gaussia荧光素酶时都可以观察到上述的效果。此外，碘 化物能够有效降低9种不同的腔肠素类似物的自发光(实施例6)。因此，在，本专利技术中一个 具体实施方案中使用的腔肠素(coelenterazine)选自由野生型腔肠素(coelenterazine native)和腔肠素类似物构成的组，上述类似物例如腔肠素cp、腔肠素f、腔肠素fcp、腔肠 素h、腔肠素hep、腔肠素I、腔肠素ip和腔肠素η。腔肠素及其类似物可以常用的浓缩的 形式使用。在一个具体实施方案中，腔肠素或其类似物以2-5 μ M的浓度在反应混合物中存 在，优选在存在金属螯合剂下，在例如1-lOmM，pH 7. 2-8. OEDTA的缓冲液中存在。包含有碘化合物源的荧光素酶反应混合物是本领域已知的。W096/40988涉及酶介 导发光的猝灭试剂和分析技术。其公开了一种用猝灭试剂降低不同样品孔之间“折射串扰 (cross-talk)，，的方法，猝灭试剂是在启动并检测到荧光素酶催化发光之后加入的。通过这种方式，可以防止样品与其中荧光素酶反应还未被启动的周围样品孔发生 不希望的串扰。试验公开了，使Renilla荧光素酶与腔肠素接触，之后加入作为猝灭试剂的Nal。因此，与本专利技术中的通过将样品和底物在碘化物源存在下结合而启动荧光素酶反 应相反，现有技术的方法中，是在测定到发光之后将碘化物加入到与底物分离开的样品中。在荧光素酶反应的启动和培育阶段是没有碘化物的。因此，现有技术中没有披露 包含腔肠素和碘化物源而不包含荧光素酶的检测试剂。当碘化物以约0. 02mM至约500mM碘化物的浓度出现在荧光素酶检测试剂或最终 的荧光素酶反应混合物(例如，与荧光素酶检测试剂混合的样品)中时，按照本专利技术中的方 法能够获得降低腔肠素自发光的良好结果。下文中的例子给出了碘化物浓度为0. 25mM(实施例4和5) ；0. 5mM(实施例6)；2. 5mM(实施例1)；和50mM(实施例2和3)的效果。因此，在本专利技术中的一个具体实施方案中，用包含腔肠素(类似物)和至少一种碘化物源的荧光素酶检测试剂启动荧光素酶反应，是在存在约0. 02mM至约500mM碘化物，如1 至250mM，或10至IOOmM下进行的。在一个具体的方面，荧光素酶反应混合物含有0. 02至 500mM的碘化物盐，优选KI。因此，本专利技术公开了碘化物作为荧光素酶检测试剂中的有新颖性的和有创造性的 成分的用途。本专利技术中的检测试剂通常不包含荧光素酶，因为酶(如果出现)将由检测 样品提供。故本专利技术还提供了一种荧光素酶检测试剂，其包含与碘化物源结合的腔肠素 (coelenterazine)或其类似物，其中所述的试剂不包含荧光素酶。本文中提供的示例性反应条件中还描述了其它成分。一般而言，为了检 测含有细胞的样品中的荧光素酶，荧光素酶检测试剂包括荧光素酶底物，如腔肠素 (coelenterazine)；维持pH的缓冲系统(如Good缓冲液，磷酸盐，Tris based缓冲液及类 似物)；用于溶解细胞和/或抑制荧光素酶的活性(增长发光半衰期)的非离子型洗涤剂 (如 Tergitol NP-9，Ig印al CA-630，Thesit, Triton XlOO 及类似物)。其它有用成分可以包括，例如，通过抑制金属依赖蛋白酶的活性而防止荧光素酶 降解的金属螯合剂(如EDTA)；和减少荧光素酶检测试剂中腔肠素降解的还原剂(如硫代 硫酸钠，TCEP, DTT及类似物)。在一个具体实施方案中，提供了一种荧光素酶检测试剂，其包括与一种碘化物源 结合的腔肠素或其类似物，并进一步包括缓冲系统，非离子型洗涤剂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用腔肠素（ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ）或其类似物作为底物检测样品中荧光素酶活性的方法，包括：（ａ）通过使所述样品与荧光素酶检测试剂接触以启动荧光素酶－催化发光反应，得到反应混合物，所述的试剂包括腔肠素和至少一种其量足以减少所述腔肠素的自发光的碘化物源，（ｂ）在适于发光的条件下培养所述的试剂混合物，和（ｃ）测定产生的光。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-12-27 07150428.6;US 2007-10-29 60/983,443一种用腔肠素(coelenterazine)或其类似物作为底物检测样品中荧光素酶活性的方法，包括(a)通过使所述样品与荧光素酶检测试剂接触以启动荧光素酶-催化发光反应，得到反应混合物，所述的试剂包括腔肠素和至少一种其量足以减少所述腔肠素的自发光的碘化物源，(b)在适于发光的条件下培养所述的试剂混合物，和(c)测定产生的光。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的至少一种碘化物源是碘盐，优选选自由 NaI、KI、LiI和NH4I或它们的任意组合所构成的组。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中的腔肠素选自由野生型腔肠素、腔肠素cp、腔 肠素f、腔肠素fcp、腔肠素h、腔肠素hep、腔肠素i、腔肠素ip和腔肠素η构成的组。4.根据前述任一权利要求所述的方法，其中所述腔肠素或其类似物以2-5μΜ的浓度 出现在反应混合物中，优选出现在PH 7....

【专利技术属性】
技术研发人员：哈里万路尼，
申请(专利权)人：珀金埃尔默健康科学有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]