本发明专利技术提供了一种检测雪白丝衣霉菌(Byssochlamys?nivea)的实时荧光PCR试剂盒和检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP混合物（三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1混合）、MgCl2和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′，下游引物：5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′，荧光探针：5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。本发明专利技术的有益效果主要体现在：检测敏感性高，特异性好，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒和检测方法。
技术介绍
雪白丝衣霉(byssochlamys nivea)是果汁生产过程中易污染的耐热霉菌之一。雪白丝衣霉可产生真菌毒素棒曲霉素/展青霉毒素和丝衣霉酸，真菌毒素对许多生物系统都有毒害作用，可致畸、致癌。被耐热霉菌污染的果汁在贮存过程中易出现变色、异味、分层沉淀等现象，甚至胖听爆裂，出现产品质量问题。雪白丝衣霉目前主要通过培养法分离，生化方法鉴定，整个过程操作繁琐，检测周期长，不利于生产时的产品监控，以及食品安全事件的应急处理，不能满足果汁产品出口中快速准确检测的需要。
技术实现思路
本专利技术首先所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足展开的实验研究，根据雪白丝衣霉的Beta tubulin的部分基因序列设计引物和TaqMan探针,提供一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR试剂盒，可实现对雪白丝衣霉菌的快速、准确、特异性检测。为此，本专利技术采用以下技术方案所述试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTP混合物、MgCl2和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组成，它们的摩尔比为1:1:1:1混合，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5'-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3'下游引物5'-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3'荧光探针5'-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3'其中FAM为荧光报告基团，BHQl为荧光淬灭基团。本专利技术另一个所要解决的技术问题是提供一种采用上述实时荧光PCR试剂盒的一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR方法。为此，本专利技术采用以下技术方案所述方法包括以下步骤(I)提取样品 DNA;(2)以待测样品DNA为模板，与权利要求I所述的实时荧光PCR试剂盒混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于实时荧光PCR仪进行荧光检测；(3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，小于Ct值，则判断为阳性，所述Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。在采用上述技术方案的基础上，本专利技术还可采用以下进一步的技术方案所述Ct值为35。所述方法的步骤(2)中PCR体系终浓度组成如下权利要求1.一种检测雪白丝衣霉菌(Byssochlamys nivea)的实时突光PCR试剂盒,所述试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTP混合物、MgCl2和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组成，它们的摩尔比为1:1:1:1混合，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下 上游引物5' -GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3' 下游引物5' -CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3' 荧光探针5' -FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3' 其中FAM为荧光报告基团，BHQl为荧光淬灭基团。2.一种检测雪白丝衣霉菌的实时荧光PCR方法，其特征在于所述方法包括以下步骤 (1)提取样品DNA； (2)以待测样品DNA为模板，与权利要求I所述的实时荧光PCR试剂盒混合配制PCR反应体系，进行PCR反应，反应产物置于实时荧光PCR仪进行荧光检测； (3)选择荧光检测模式FAM荧光，基线调整取3 15个循环的荧光信号，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测样品荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，小于Ct值，则判断为阳性，所述Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。3.如权利2所述的方法，其特征在于所述Ct值为35。4.如权利2所述的方法，其特征在于所述方法的步骤(2)中PCR体系终浓度组成如下5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法的步骤(2)中PCR反应条件如下 95°C预变性3min ;95°C变性15s，59°C退火40s，40个循环。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法的步骤(2)中PCR反应体系中加有ROX染料，可适用于需要使用ROX校正染料的实时荧光PCR仪器，所述ROX染料在PCR体系终浓度为O. 05 O. 8 μ mol/L 。全文摘要本专利技术提供了一种检测雪白丝衣霉菌(Byssochlamys nivea)的实时荧光PCR试剂盒和检测方法。所述试剂盒主要包括特异性引物和荧光探针、PCR缓冲溶液、dNTP混合物(三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸的摩尔比为1:1:1:1混合)、MgCl2和DNA聚合酶，所述特异性引物和荧光探针序列如下上游引物5′-GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG-3′，下游引物5′-CCATGGTACCAGGCTCAAGGT-3′，荧光探针5′-FAM-ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG-BHQ1-3′，其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。本专利技术的有益效果主要体现在检测敏感性高，特异性好，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。文档编号C12Q1/04GK102952887SQ20121051257公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日专利技术者张慧, 姜侃, 陈小珍, 汪新 申请人:浙江省质量检测科学研究院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测雪白丝衣霉菌(Byssochlamys?nivea)的实时荧光PCR试剂盒，所述试剂盒包括特异性引物、荧光探针、PCR缓冲液、dNTP混合物、MgCl2和DNA聚合酶；所述dNTP混合物由三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸和三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸组成，它们的摩尔比为1:1:1:1混合，其特征在于所述特异性引物和荧光探针序列如下：上游引物：5′?GGTTGTTGTTGACTTCCCTGATG?3′下游引物：5′?CCATGGTACCAGGCTCAAGGT?3′荧光探针：5′?FAM?ACGCTCCATATGCTGACCCTCCTCCTAG?BHQ1?3′其中FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张慧，姜侃，陈小珍，汪新，
申请(专利权)人：浙江省质量检测科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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