一种早代鉴定转基因玉米纯合体的方法技术

本发明专利技术公开了早代鉴定转基因玉米纯合体的方法，包括以下步骤：A1、提取T1代转基因玉米DNA；A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性T1代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效率；A5、计算目的基因在各T1代植株中的相对含量；A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于1时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于0.5时，该植株为杂合体。仅通过简单的普通PCR和荧光定量PCR等操作，同时对T1代阳性植株中参考基因与目的基因Ct比值进行分析，即能对单拷贝转基因玉米在T1代高效、简易地鉴定出纯合体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业育种
，尤其涉及的是一种早代鉴定转基因玉米纯合体的简易方法。
技术介绍
玉米已成为全球种植面积最大的粮、经、饲三元谷类作物，随着分子生物学和生物技术的发展，玉米转基因技术已经成为研究玉米基因功能和创制高抗、优质、高产玉米新品种的重要手段之一。而鉴定目的基因纯合的玉米转化体是玉米转基因技术中一个必不可少的环节。由于转基因沉默现象的存在，人们往往选择目的基因以单拷贝或低拷贝形式插入 的转基因TO代进行下一步的纯合体筛选。常规的方法是对TO代(转基因当代)转化体自交获得Tl代转基因植株，然后对每个独立分离的Tl代转基因植株产生的T2代个体进行转基因分离比率的研究。通常采用PCR方法鉴定出T2代不再分离的转基因株系(即不再出现不含目的基因植株的株系)，被鉴定为纯合的转基因株系，此方法不仅工作量大、而且成本高、周期长，不利于快速获得纯合的转基因株系和转基因玉米新品种的育成。2009年刘楠等建立了一种利用4个PCR引物的多重PCR反应来鉴定转基因玉米纯合体的方法，用该方法鉴定玉米转基因纯合体的前提条件是目的基因在玉米基因组DNA中插入位点序列已知。而弄清楚某个外源目的基因在植物基因组中的插入位点则是转基因检测中另外一个技术难题，且操作繁琐，需要较长的周期，尤其是对一些研究体系不够完善的科研单位。对于很多转基因玉米而言，在Tl代尚未鉴定出目的基因在玉米基因组DNA的插入位点，因此该方法在早代鉴定出转基因玉米纯合体的应用上还受到很大的限制。2004年，杜春芳等提出了用基于TaqMan探针的双重定量PCR技术来鉴定Tl代转基因纯合体。该技术在定量PCR反应体系中，加入2对PCR引物和TaqMan探针。第I对为扩增目的基因的引物和探针，另I对为扩增参考基因的引物和探针。而目的基因和参考基因TaqMan探针5’端标记了不同的荧光报告基团，可在同一 PCR反应中同时扩增目的基因和参考基因，根据荧光信号的强弱分别计算出样品中目的就基因和参考基因的Ct值，继而得出二者间的比例，并以此鉴定出纯合的Tl代转基因植株。基于TaqMan探针的双重定量PCR技术的缺点主要表现在以下几个方面，一是探针设计难度大，既要避免二级结构，又要严格控制GC含量，避免重复的核酸序列，避免引物与探针形成互补，否则极大影响扩增效率导致检测结果不准确。其二，探针的合成和双荧光标记成本高，且不能通过溶解曲线判断扩增产物的特异性。其三，该方法主要用于鉴定双子叶植物烟草和拟南芥转基因纯合体。而在不依赖于已知目的基因插入位点及侧翼序列的情况下，如何快速、简易地鉴定出转基因玉米纯合体，目前还未见相关方法报道。
技术实现思路
为解决针对传统技术及现有相关技术的存在的缺点，专利技术了一种不依赖于目的基因在玉米基因组中插入位点，且低成本、高效率、操作简易的转基因玉米纯合体的早代检测方法，即基于SYBR Green I染料荧光定量PCR技术的转基因玉米纯合体早代鉴定方法。本专利技术技术方案如下 ，包括以下步骤A1、提取Tl代转基因玉米DNA ;A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性Tl代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效率;A5、计算目的基因在各Tl代植株中的相对含量;A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于I时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于O. 5时，该植株为杂合体。SYBR Green I是一种结合于所有DNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，在PCR反应过程中随着扩增产物的积累荧光信号不断增强，可以根据荧光信号强弱分辨样品间仅2倍起始DNA和RNA水平上的差异。目前已广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化以及比较不同组织或细胞中的mRNA表达差异。鉴于Tl代单拷贝转基因株系中杂合体和纯合体最本质的区别是，在杂合体中目的基因只存在于同源染色体的中的一条染色体，而纯合体中目的基因则同时存在于同源染色体中的两条染色体，即纯合体中目的基因含量是杂合体中的2倍。这种差异可以被基于SYBR Green I染料的荧光定量PCR技术灵敏地检出。本专利技术利用低成本的SYBR Green I作为荧光染料，建立了基于荧光定量PCR的快速转基因玉米纯合体检测技术。由于基于SYBG Green I的荧光定量PCR技术不需要设计复杂的特异探针，降低了整个技术的难度，同时也极大的减少了技术成本。另外，无须了解目的基因在植物基因组中的整合位点和侧翼序列，以玉米基因组中的单拷贝基因为参照基因，仅通过简单的普通PCR和荧光定量PCR等操作，同时对Tl代阳性植株中参考基因与目的基因Ct比值进行分析，即能对单拷贝转基因玉米在Tl代高效、简易地鉴定出纯合体。本专利技术适用于对单拷贝转基因玉米进行早代纯合体的鉴定。附图说明图I :参考基因6觀2] 26167856标准曲线，扩增效率94.2%，相关系数0.998 ；图2 :目的基因bar标准曲线，扩增效率94.5%，相关系数O. 997 ；图3 :参考基因GRMZM2G167856的溶解曲线，溶解峰单一，产物Tm在80_90°C ；图4:目的基因bar的溶解曲线，溶解峰单一，产物Tm在80_90°C ；图5 :含bar基因的表达载体；图6 =Southern杂交鉴定TO代目的基因拷贝数；图7 :来自于同一 TO代植株的9个Tl植株PCR扩增出特异条带，方框处表示扩增出的特异性目的条带；图8 =Tl-I植株对应的T2代株系PCR扩增bar基因情况；图9 Τ1-3植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况；图10 Τ1-4植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况；图11 Τ1-8植株对应的Τ2代株系PCR扩增bar基因情况，图中O表示未扩增出bar基因特异条带的植株，I表示扩增出bar基因特异条带的植株；具体实施例方式以下结合具体实施例，对本专利技术进行详细说明。2. 2. ITl代转基因玉米DNA提取对单个阳性TO转基因玉米进行人工套袋自交，获得TO代果穗。从每个TO代植株收获的一穗种子进行单粒播种，获得对应的Tl代转基因植株，并进行编号。对来自同一个TO代的Tl代植株，随机抽取20株左右，在3-4叶期分别提取叶片总DNA。I)取叶片2g，剪碎后于液氮中迅速研磨成粉(研磨后的叶片占离心管体积的1/4到 1/3)。 2)将上述冻粉迅速转入预冷的离心管中，迅速加入900 μ I已预热到65°C的CTAB提取液中，迅速混勻，于65°C水浴40min。期间轻柔混勻3 4次(每隔IOmin混勻一次)。3)取出离心管，冷至室温，加入等体积(ΙΟΟΟμ I)的氯仿-异戊醇(氯仿异戊醇=24 : I, ν/ν),在摇床上轻轻振荡摇勻lOmin。4)室温下离心IOmin (IOOOOrpm)，取上清液转至新的2ml离心管中，再加入ΙΟΟΟμ I的24 : I的氯仿-异戊醇，在摇床上轻轻振荡摇匀lOmin。5)室温下离心IOmin(IOOOOrpm),取上清液至新的2ml离心管中，加入等体积已预冷至_20°C的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种早代鉴定转基因玉米纯合体的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、提取T1代转基因玉米DNA；A2、选择参照基因、设计目的基因和参照基因的PCR引物；A3、使用普通PCR方法对阳性T1代转基因植株进行预检测；A4、证明基因特异扩增，获得基因扩增效率；A5、计算目的基因在各T1代植株中的相对含量；A6、检出转基因玉米纯合体，当目的基因相对含量约等于1时，该植株为纯合体；当基因相对含量约等于0.5时，该植株为杂合体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈亚欧，潘光堂，彭焕伟，葛飞，张志明，林海建，江舟，赵茂俊，杨珊，罗旭，张兵，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：