本发明专利技术所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中存在的对产毒微囊藻检测方法复杂、仪器要求高等问题，提供一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法及其试剂盒。一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法，包括如下步骤：(1)从检测地取样微囊藻，并提取基因组DNA；(2)设计合成微囊藻，包括产毒和非产毒株的ropC1基因和产毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyI、mcyJ基因片段的7对引物；(3)使用上述设计的特异性引物分别进行PCR扩增反应，最后进行电泳凝胶检测。本发明专利技术以多个基因作为分子指标，提高了检测精度，操作简便，易于掌握，可快速检测出水体中的微囊藻，并能有效识别是否为产毒株。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子生物
，具体涉及一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法及其试剂盒。
技术介绍
自上世纪60年代起，就在太湖中发现了蓝藻水华。到目前为止，不仅云南滇池、江苏太湖、安徽巢湖、武汉东湖和上海淀山湖等大型淡水湖泊已经发生了严重的蓝藻水华污染，而且长江、黄河以及珠江中下游的许多湖泊和水库也都相继发生了不同程度的蓝藻水华。蓝藻水华持续大面积的发生，极大地危害了水体生态系统的结构和功能，某些水华种类 产生的藻毒素对人类的健康也构成了直接或潜在的影响。如，微囊藻属(Microcystis)-富营养化水库水体中的常见的优势藻类，隶属于蓝藻门、色球藻纲(Chroococcophyceae)、色球藻目(Chroococcales)、色球藻科(Chrococcaceae),其部分株系能产生微囊藻毒素。这种毒素是一种肝毒素，人类或动物长期饮用含有这一毒素的水体，可能会引发肝损伤甚至肝癌。正因为如此，各国广泛开展快速检测藻毒素及藻细胞的工作。现阶段，用于检测微囊藻毒素的方法众多，先后研制出生物分析法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、电化学免疫分析法、电化学生物传感器检测法、分子生物学检测法等。但是，分子生物学检测法可以灵敏、快速、准确、高效地检测出物种，它不似高效液相色谱法、酶联免疫吸附法、电化学免疫分析法、电化学生物传感器检测法等对仪器要求过高，仅靠一台PCR仪即可实现快速检测，费用也相对低廉，在定性及定量实验中已取得较好效果，备受研究人员青睐。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，为了克服现有技术中存在的对产毒微囊藻检测方法复杂、仪器要求高等问题，提供一种对产毒微囊藻特异性检测的多重PCR方法及其所使用的试剂盒。为了解决现有技术中的这些问题，在第一个方面，本专利技术提供的技术方案是一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法，包括如下步骤(I).从检测地取样微囊藻，并提取基因组DNA，(2).设计并合成微囊藻，包括产毒和非产毒株的ropCl基因和产毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyl> mcyj 基因片段的 7 对引物引物序列(5’一3’)rpoC ITCFl CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG,rpoC ITCRl ACTTCATCCAAGACGTGCC ；mcyA TCFl GCATCGGAGACAGAAACAGG,mcyA TCRl AAGTTACCCAAACCGAAAGG ；mcyB TCFl CCAAACTGGTGCCGAATC,mcyB TCRl CAAGATGACAAAGGCAGAAGG ；mcyD TCFl GCCATTTAGAAGGTGCTGC,mcyD TCRl GGCTGAGTGATTTGGGTTTC ；mcyE TCFl CAAACTGCTCCAGGTATCATTG,mcyE TCRl TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG ；mcyl TCFl TTGGTACTCTGGTGGCTCAC,mcyl TCRl CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT ；mcyj TCFl TGACCGCTTTAGAATGTGCT, mcyj TCRl ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG(3).使用上述设计的特异性引物分别进行PCR扩增反应，最后进行电泳凝胶检测。所述的微囊藻种类，包括但不限于铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、绿色微囊藻(Microcystis viridis)、惠氏微囊藻(Microcystis wesenbergii)、水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)、华美微囊藻(Microcystis elabens)、鱼害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe)等。在上述的检测方法中，专利技术人设计针对微囊藻中编码RNA聚合酶Y亚基的IOpCl基因特异性扩增的引物，该引物仅能扩增微囊藻属藻株，可有效区分微囊藻及其他藻株；所设计的mcyABDEIJ引物可将微囊藻中含有微囊藻毒素合成酶基因(mcy genes)及未含有该基因的藻株区分。专利技术人设计多重PCR方法以检测微囊藻的目的在于，实际PCR检测过程中，部分因素或多或少会对PCR扩增产生干扰，以至于产生假阴性结果，此时，以单一目的条带为检测基准的方法无法扩增出目的片段，至此判断无阳性结果，造成实验误差。多重PCR检测方法则极大提高检测效果，削弱未知因素的干扰强度，以多条目的片段为检测指标，达到较为准确的检测。同时，多重PCR的检测灵敏度优于普通PCR检测的检测灵敏度，通过调整及优化实验方案，检测效率更高，扩增时间也大为缩短。为了解决现有技术中的这些问题，在第二个方面，本专利技术提供的技术方案是一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括如下的引物引物序列(5’一3’)rpoCl TCFl CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG,rpoCl TCRl ACTTCATCCAAGACGTGCC ；mcyA TCFl GCATCGGAGACAGAAACAGG,mcyA TCRl AAGTTACCCAAACCGAAAGG ；mcyB TCFl CCAAACTGGTGCCGAATC,mcyB TCRl CAAGATGACAAAGGCAGAAGG ；mcyD TCFl GCCATTTAGAAGGTGCTGC,mcyD TCRl GGCTGAGTGATTTGGGTTTC ；mcyE TCFl CAAACTGCTCCAGGTATCATTG,mcyE TCRl TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG ；mcyl TCFl TTGGTACTCTGGTGGCTCAC,mcyl TCRl CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT ；mcyj TCFl TGACCGCTTTAGAATGTGCT,mcyj TCRl ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG。所述的可检测的产毒微囊藻种类，包括但不限于铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)、绿色微囊藻(Microcystis viridis)、惠氏微囊藻(Microcystiswesenbergii)、水华微囊藻(Microcystis flos-aquae)、华美微囊藻(Microcystiselabens)、鱼害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe)等。一种微囊藻mcy基因调控微囊藻毒素的合成，仅存在于产毒种体内，是用于区分产毒与非产毒藻种良好的分子指标。它共分为十个片段(mcyA J)，包含两个大型双向转录操纵子(mcyABC和mcyDEFGHIJ)。不同片段行使不同的功能，mcyABC基因编码五组NRPS模块；mcyD基因调控两组PKS模块，而mcyE和mcyG基因混合 编码NRP S-PK S区域。其他几个基因(如mcyF和mcyHIJ)也直接或间接参与调控微囊藻毒素的合成。本专利技术针对不同的功能区(mcyABDEIJ片段)以及ropC I基因，设计特异性引物，通过PCR扩增片段长度间的差异，得以识别特异性片段。需要说明的是，由于ropCl基因针对微囊藻(包括产毒株和无毒株)设计，当检测品中出现产毒株或无毒株本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产毒微囊藻特异性多重PCR检测方法，包括如下步骤：(1).从检测地取样微囊藻，并提取基因组DNA，(2).设计并合成微囊藻包括产毒和非产毒株的ropC1基因和产毒微囊藻mcyA、mcyB、mcyD、mcyE、mcyI、mcyJ基因片段的7对引物：引物???????序列(5’→3’)rpoC1?TCF1??CAGTTATCTCAGTATCCTGCTCG，rpoC1?TCR1??ACTTCATCCAAGACGTGCC；mcyA?TCF1???GCATCGGAGACAGAAACAGG，mcyA?TCR1???AAGTTACCCAAACCGAAAGG；mcyB?TCF1???CCAAACTGGTGCCGAATC，mcyB?TCR1???CAAGATGACAAAGGCAGAAGG；mcyD?TCF1???GCCATTTAGAAGGTGCTGC，mcyD?TCR1???GGCTGAGTGATTTGGGTTTC；mcyE?TCF1???CAAACTGCTCCAGGTATCATTG，mcyE?TCR1???TGAGTCTGGGAGATTAAAGTCG；mcyI?TCF1???TTGGTACTCTGGTGGCTCAC，mcyI?TCR1???CTCCTCCTGAAGCACTTGTAAT；mcyJ?TCF1???TGACCGCTTTAGAATGTGCT，mcyJ?TCR1???ACTAATTCCTTGGCTAATCTGG。(3).使用上述设计的特异性引物分别进行PCR扩增反应，最后进行电泳凝胶检测。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐晨，董丽，饶涛，何培民，贾睿，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
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