本发明专利技术公开了一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸乳球菌，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过在乳酸乳球菌L.lactis NZ9000中过量表达GroEL‑V蛋白，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactis NZ‑GroEL‑V。生长性能试验表明，MCs胁迫条件下培养22h后，L.lactis NZ‑GroEL‑V菌株相比对照生物量提高了约35.4％；在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫12h后的重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了32.1％和43.5％。
【技术实现步骤摘要】
一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸乳球菌
本专利技术涉及一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸乳球菌，属于生物工程
技术介绍
食品安全是关系到人类健康和国计民生的重大问题。在众多威胁食品安全的污染源中，微囊藻毒素(MCs)由于毒性强、在食物链中波及范围广，日益成为危害人类健康的重要杀手。MCs是一类单环七肽物质，其化学性质稳定，自然降解缓慢。由于微生物具有使用成本低、运行周期短等特点，在生物防治MCs中具有较大的应用潜力和研究价值。其中，益生菌对MCs的干预作用因其公认的安全性(GRAS)成为真正能够实现在清除MCs过程中与水源、食品“零距离”接触的生物防治剂。然而，益生菌对MCs的干预作用的机理并不明确。一方面，益生菌自身的性能决定了其对MCs的干预能力以及特有的干预作用机制，这取决于其基因型，以及由此表现出的对MCs的代谢转化性能，或是对MCs进行结合、吸附的结构或形态特征。另一方面，微生物的内在、外在环境又影响并改变着它对MCs的干预过程和干预效果，如所处胃肠道的不同生理环境、MCs的胁迫条件等。这些改变可能涉及到益生菌的转录组、蛋白组、代谢组的变化及整个代谢网络的调整，从而实现了对MCs的转化。因此，益生菌清除MCs技术的建立不仅建立在对益生菌性能及其去毒机制的解析之上，也建立在对益生菌干预过程的理解之上，这样才能最终实现益生菌对MCs的高效干预与控制。在利用乳杆菌对MCs进行清除的研究中发现，由于菌株受到MCs的胁迫作用，导致菌株的活性受到影响，进而影响其清除效果。但是MCs对菌株的胁迫机理也不明确。专利技术人研究了MCs胁迫条件下LactobacilluscaseiATCC334的蛋白质组学，研究发现，其分子伴侣GroEL蛋白表达受到MCs胁迫的影响。已有报道在L.lactisNZ9000中表达了GroEL蛋白后，菌株对MCs的耐受性显著提高。然而，从已有报道的情况来看，耐受性还有待加强。
技术实现思路
为了克服上述问题，本专利技术对GroEL蛋白进行了突变，结果发现表达突变GroEL的乳酸菌具有更强的MCs耐受性。本专利技术的第一个目的是提供了一种分子伴侣蛋白GroEL-V，所述分子伴侣蛋白GroEL-V的氨基酸序列是在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第249位的氨基酸A突变成为赖氨酸K且同时将第264位的赖氨酸K突变成为异亮氨酸I。在本专利技术的一种实施方式中，所述SEQIDNO.1所示的氨基酸序列由核苷酸序列如SEQIDNO.2所示的序列编码。本专利技术的第二个目的是提供一种提高乳酸乳球菌抵御MCs胁迫的方法，所述方法是在乳酸菌中过表达本专利技术的分子伴侣蛋白GroEL-V。本专利技术的分子伴侣蛋白GroEL-V，其氨基酸序列是在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第249位的氨基酸A突变成为赖氨酸K且同时将第264位的赖氨酸K突变成为异亮氨酸I。在本专利技术的一种实施方式中，所述乳酸菌，为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法是以L.lactisNZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148、pNZ8048、pNZ5319中的一种为载体，过表达分子伴侣蛋白。本专利技术的第三个目的是提供一种微囊藻毒素胁迫抗性提高的乳酸菌，所述乳酸菌过表达本专利技术的分子伴侣蛋白GroEL-V。本专利技术还要求保护所述乳酸菌在清除微囊藻毒素方面、制备生物防治剂方面的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术通过在乳酸乳球菌L.lactisNZ9000中过量表达GroEL-V蛋白，得到了一株MCs胁迫抗性能力显著提高的重组乳酸乳球菌L.lactisNZ-GroEL-V。生长性能试验表明，MCs胁迫条件下培养22h后，L.lactisNZ-GroEL-V菌株相比对照生物量提高了约35.4％；在MCs浓度分别为50μg/mL和100μg/mL的GM17中胁迫12h后的重组菌对MCs的耐受性分别比对照菌提高了32.1％和43.5％。具体实施方式实施例1重组菌株的构建重组菌LactococcuslactisNZ-GroEL-V包括：(1)以L.caseiATCC334的基因组为模板，根据GroEL的序列(氨基酸序列如SEQIDNO.1所示、核苷酸序列如SEQIDNO.2所示)设计引物，PCR扩增获得目的基因片段得到表达GroEL的基因片段。(2)将步骤(1)得到的基因片段连接到PMD18-T载体上，再转化到大肠杆菌中，得到重组菌；从重组菌中提取质粒。(3)根据要突变的第249位和第264位的前后序列，设计两对引物，引物上相应的位点核苷酸为突变后的核苷酸。利用HSPCR酶(购于TaKaRa公司)采用全质粒PCR的方法进行PCR，PCR产物线性化处理后转化大肠杆菌E.coliJM109感受态细胞。(4)分别利用针对第249位和第264位的位点突变设计的引物以质粒为模板进行PCR，先利用针对第249位突变设计的引物以质粒为模板进行PCR，再以针对第264位点突变设计的引物以PCR得到的产物为模板进行PCR，可得到发生了两个位点突变的A249K-K264I的核苷酸片段，得到表达突变的GroEL-V的片段。(5)将步骤(1)和步骤(4)得到的片段，分别和载体pNZ8148酶切、连接。连接产物转化大肠杆菌感受态，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后再进行测序鉴定，最终获得含有正确序列的重组质粒pNZ8148/GroEL、pNZ8148/GroEL-V。(6)然后从重组大肠杆菌中提取重组质粒，电转化L.lactisNZ9000感受态细胞，氯霉素平板上筛选阳性克隆，经菌落PCR验证和酶切验证，片段大小正确后，最终获得含有正确重组质粒的菌株L.lactisNZ-GroEL、L.lactisNZ-GroEL-V。实施例2重组菌株的诱导表达将菌株L.lactisNZ-Vector、L.lactisNZ-GroEL、L.lactisNZ-GroEL-V接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD6000.4时加入10ng/mL的nisin诱导培养8h，收集诱导后的细胞，经50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)离心洗涤两次后重悬于相同的缓冲液中。将菌悬液置于冰上超声破碎15min，离心收集上清液，进行SDS-PAGE分析。经SDS-PAGE分析，重组菌L.lactisNZ-GroEL-V成功地表达了GroEL-V蛋白。实施例3酸胁迫下的生长性能比较本专利技术考察了菌株在胁迫条件下的生长情况。将菌株L.lactisNZ-Vector、L.lactisNZ-GroEL、L.lactisNZ-GroEL-V接种于含有10μg/mL氯霉素的GM17(5mL)培养基中，30℃静置培养过夜，以4％的接种量转接至50mL含有10μg/mL氯霉素的GM17培养基中，待生长至OD6000.4时加入10ng/mL的nisin，诱导培养至OD2.0。将诱导后的培养液以4％的接种量转接至新鲜的GM17(含10μg/mL氯霉素，10ng/mLnisin，MCs浓度为1μg/mL)培养基中。分别测定L.lactisN本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种提高乳酸乳球菌抵御MCs胁迫的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过表达分子伴侣蛋白GroEL‑V；所述分子伴侣蛋白GroEL‑V，其氨基酸序列是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第249位的氨基酸A突变成为赖氨酸K且同时将第264位的赖氨酸K突变成为异亮氨酸I。
【技术特征摘要】
1.一种提高乳酸乳球菌抵御MCs胁迫的方法，其特征在于，所述方法是在乳酸菌中过表达分子伴侣蛋白GroEL-V；所述分子伴侣蛋白GroEL-V，其氨基酸序列是在SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的基础上，将第249位的氨基酸A突变成为赖氨酸K且同时将第264位的赖氨酸K突变成为异亮氨酸I。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌为乳酸乳球菌或者干酪乳杆菌。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是以L.lactisNZ9000为宿主，以表达质粒pNZ8148、pNZ8...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹书华，
申请(专利权)人：曹书华，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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