【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种分泌表达胰高血糖素样肽I的乳酸乳球菌MG1363的制备方法及其在治疗II型糖尿病中的应用，通过构建pMG36e-GLP-1组成型表达载体，在添加乳酸乳球菌穿膜肽SPusp45后，采用电转的方法将重组质粒转入乳酸乳球菌MG1363实现GLP-1的分泌表达。同时，乳酸乳球菌优良的耐酸、耐胆盐和其益生特性，为其在肠道中的定植和持续不断的表达提供理论基础，最终实现在II型糖尿病中的治疗作用。
技术介绍
胰高血糖素样肽I，简称GLP-1，由胰高血糖素原基因表达，肠粘膜L细胞、胰岛α细胞、及神经元均有该基因存在，其中肠道细胞和神经元中胰高血糖素原基因的表达产物是GLP-1。GLP-1有两种生物活性形式，分别为GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1约80％的循环活性来自GLP-1(7-36)酰胺。GLP-1作为一种肠促胰素，由肠道L细胞分泌，具有葡萄糖依赖的胰岛素促泌作用、抑制胰高血糖素分泌、刺激β细胞增殖分化和抑制β细胞凋亡、抑制食欲及摄食、延缓胃排空，能恢复II型糖尿病患者受损的“肠促胰素效应”，是一类新型的糖尿病治疗药物。但是，...
【技术保护点】
一种分泌表达GLP‑1的乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：一、pMG36e‑GLP‑1重组质粒构建1、PstI‑SPusp45‑GLP‑1‑HindIII全序列化学合成获得pUC57‑GLP‑1重组质粒；2、构建pMG36e‑GLP‑1重组质粒A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57‑GLP‑1质粒；B酶切pMG36e，pUC57‑GLP‑1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；D酶连酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和...
【技术特征摘要】
1.一种分泌表达GLP-1的乳酸乳球菌的制备方法，其特征在于：一、pMG36e-GLP-1重组质粒构建1、PstI-SPusp45-GLP-1-HindIII全序列化学合成获得pUC57-GLP-1重组质粒；2、构建pMG36e-GLP-1重组质粒A采用OMEGA质粒小提试剂盒，提取pMG36e，pUC57-GLP-1质粒；B酶切pMG36e，pUC57-GLP-1酶切体系如下，总体系为25μL，37℃酶切4h；C配制2％琼脂糖凝胶电泳，110V电压下电泳45min；在276bp和3600bp切胶回收；D酶连酶连体系如下，总体系10μL，Fragment：Vector＝5：1和10：1，10℃过夜；E转化a从-80℃冰箱中取200μL MC1061感受态细胞悬液，冰上解冻；b加入2μL质粒溶液，质粒浓度不低于200ng/μL，轻轻摇匀，冰上放置30min后；c 42℃水浴中热击90s，热击后迅速置于冰上冷却3-5min；d向管中加入800μL LB液体培养基，混匀后37℃振荡培养1h，使细菌恢复正常生长状态，离心4000rpm，1min，弃上清800μL，留200μL菌液，混匀；e将上述菌液摇匀后取200μL涂布于含300ng/μL红霉素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24h，挑取单克隆；F送公司测序；G测序成功后，采用OMEGA质粒小提试剂盒提取重组质粒pMG36e-GLP-1，保存备用，
\t步骤同步骤一；二、pMG36e-GLP-1电转乳酸乳球菌MG1363A乳酸菌感受态制备a取-80℃冻存的乳酸乳球菌MG1363接种于5mL含有5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；b将获得菌液按照1％接种于含有2.5％Gly和5％葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD600值为0.3-0.4，收集备用；c将以上收集的菌体培养物冰浴10min，4℃离心5000rpm/min，5min；收集菌体；d沉淀用冰冷的10％蔗糖和10％甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000rpm/min，5min，收集沉淀；e最后沉淀重悬于1/100体积10％蔗糖和10％甘油混合溶液中，冰浴10min后使用；B乳酸乳球菌MG1363电转化a取2μL重组质粒，浓度不低于150ng/μL，与上述方法制备的50μL冰冷的乳酸菌感受态细胞悬液轻轻混匀后，加入预冷的间距0.1cm电击杯中，置于冰上静置5min，设置条件为1800V，200Ω，25μF；b电击完毕后，迅速将电击杯中的液体吸入到离心管中，同时计入800μL的含5％葡萄糖的M17液体培养...
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