一种丙酸杆菌表达载体的构建及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种丙酸杆菌表达载体的构建及应用，本发明专利技术中构建的丙酸杆菌表达载体能够在致病性丙酸菌稳定表达，且具有极高的转化效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种丙酸杆菌表达载体的构建及应用。
技术介绍
丙酸杆菌(P.granulosum)是一种革兰氏阳性细菌，按发现最初发现来源可分为乳品丙酸菌和皮肤丙酸菌两类。乳品丙酸菌是最初从发酵乳制品中分离到，广泛应用在乳制品生产，也用于发酵生产维生素B12，丙酸，杆菌素等。皮肤丙酸菌，寄生于人类皮肤上，为条件性致病菌。质粒是基因工程中最常用基因载体，是对原核生物进行基因改造最重要的工具。目前已经有很多针对乳品丙酸杆菌的质粒载体，用于改造乳品丙酸杆菌的发酵性能。对于致病性丙酸菌，目前只有很少数质粒载体能用于致病性丙酸菌。本专利技术开发一种能在致病性丙酸杆菌表达质粒，用于对致病性丙酸杆菌基因改造，可用于研究致病性丙酸杆菌的致病机制。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够在致病性丙酸杆菌中稳定表达的丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒。本专利技术的第一方面，提供了一种丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒，所述质粒包括SEQIDNO.:2所示的多核苷酸序列和hygr筛选标记(潮霉素抗性基因)。在另一优选例中，所述质粒的序列如SEQIDNO.:1所示。在另一优选例中，所述质粒以pUC18载体为骨架。本专利技术的第二方面，提供了一种制备丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒的方法，包括步骤：(1)获得SEQIDNO.:2所示的多核苷酸序列，并将其插入到pUC18载体骨架上获得的质粒命名为pPA00质粒；(2)获得hygr基因序列，并将其插入到所述pPA00质粒上，从而获得所述丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒，命名为pPA01质粒。在另一优选例中，所述步骤(1)中，用EcoRⅠ酶切SEQIDNO.:2所示序列和pUC18质粒，然后使用T4连接酶连接，从而构建pPA00质粒。在另一优选例中，所述步骤(2)中，以pSLIK-Hygro质粒为模板扩增hygr基因序列，从而获得hygr基因序列。在另一优选例中，所述步骤(2)中，使用SEQIDNO.:3和SEQIDNO.:4所示的引物对，扩增所述hygr基因序列。在另一优选例中，所述步骤(2)中，将扩增获得hygr基因序列插入pPA00质粒的HindIII和XbaI之间，从而构建pPA01质粒。本专利技术中构建的丙酸杆菌表达载体能够在致病性丙酸菌稳定表达，且具有极高的转化效率应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步陈述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。实施例1参考P.granulosum中分离pPG01质粒，参考其中rep区域，这一区域是影响质粒在丙酸菌中复制功能元件，合成这一区域序列，插入到pUC18载体上，然后再插入一个hygr筛选标记，构建成一个丙酸杆菌表达质粒pPA01。1.实验步骤1.1NCBI数据库中获得pPG01全长序列(NC_004526.2)，合成其中1651～3539之间的序列，在序列两侧加上EcoR1酶切位点。1.2用EcoRⅠ酶切rep序列和pUC18质粒(购自Invitrogen公司)，T4连接酶将两个片段连接，构建pPA00质粒。表1EcoRⅠ酶切体系37℃孵育2h后，琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。表2连接体系21℃孵育1h后，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆。1.3以pSLIK-Hygro(购自Invitrogen公司)为模板扩增hygr序列，将扩增得到序列插入pPA00的HindIII和XbaI之间，构建好pPA01质粒。表3扩增hypr序列引物表4PCR扩增体系PCR反应程序95℃预变性1min，PCR循环程序95℃，10s，褪火58℃，15s，延伸72℃，1min，30个循环。表5HindIII和XbaI酶切体系37℃孵育2h后，琼脂糖凝胶电泳，回收酶切片段。表6连接体系21℃孵育1h后，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，筛选阳性克隆。1.4对构建好pPA01全质粒进行测序，获得pPA01全长序列1.5pPA01电击转化P.granulosum，用潮霉素B筛选阳性克隆1.6提取P.granulosum抗潮霉素B阳性克隆质粒，测序验证是否是转染的质粒。2.实验结果2.1质粒测序结果测序获得pPA01全长序列，共5590bp，具体序列如SEQIDNO.:1所示，完全符合设计预期。转化P.granulosum后，筛选阳性克隆，计算表明，该质粒具有极高的转化效率。提取质粒经过测序验证，与转染质粒相同。表明构建的载体能在P.granulosum中复制，能成功表达抗性基因。在本专利技术提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本专利技术的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒，其特征在于，所述质粒包括SEQ ID NO.:2所示的多核苷酸序列和hygr筛选标记(潮霉素抗性基因)。

【技术特征摘要】
1.一种丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒，其特征在于，所述质粒包括SEQIDNO.:2所示的多核苷酸序列和hygr筛选标记(潮霉素抗性基因)。2.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述质粒的序列如SEQIDNO.:1所示。3.如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述质粒以pUC18载体为骨架。4.一种制备丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒的方法，其特征在于，包括步骤：(1)获得SEQIDNO.:2所示的多核苷酸序列，并将其插入到pUC18载体骨架上获得的质粒命名为pPA00质粒；(2)获得hygr基因序列，并将其插入到所述pPA00质粒上，从而获得所述丙酸杆菌(P.granulosum)表达质粒，命名为...

【专利技术属性】
技术研发人员：桑伟健，
申请(专利权)人：上海麒盟生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31