一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物；将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段；在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss‑CHIg‑hG1上，即获得制备膜蛋白CD14抗体的表达载体。该方法构建的表达载体能够进行高效表达，以解决CD14抗体表达量低的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法
本专利技术涉及表达载体
，具体涉及一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法。
技术介绍
CD14有mCD14和sCD14两种类型，是细胞表面的糖蛋白，其生物学功能主要是识别、结合LPS或LPS/LBP复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应中起重要作用。筛选出能识别CD14分子的抗体，对研究CD14分子的功能及整个通路都具有重要作用。若能够完全封闭CD14的功能，特异性的阻断CD14与LPS及LPS/LBP复合物结合，就能够防止或中止LPS性炎症反应、内毒素休克等病理反应的发生，对于临床治疗内毒素血症、内毒素休克等也将会较好的应用前景。膜蛋白表达成本较高，常规的抗体制备方法，无论是单克隆抗体还是多克隆抗体，均需要制备大量的膜蛋白用于免疫和检测。用噬菌体展示的抗体库的筛选方法，只需要少量的抗原就可以完成筛选和检测。同时，由于膜蛋白本身结构的复杂性，外源表达的膜蛋白在构象上并不能完全模拟细胞表面的膜蛋白，导致用外源蛋白免疫的方法制备的抗体不能很好识别细胞表达的膜蛋白。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，该方法构建的表达载体能够进行高效表达，以解决CD14抗体表达量低，不能很好识别细胞表达的膜蛋白的问题。本专利技术通过以下技术方案实现：一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：步骤(1)：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，即获得膜蛋白CD14表达载体。作为进一步优选的，所述步骤(2)中，通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游。作为进一步优选的，所述步骤(3)中，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，将产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。本专利技术的有益效果为：本专利技术构建的表达载体能够在系统中进行高效表达，通过重组抗体技术制备表达量高的CD14抗体，能更好地识别膜蛋白。附图说明图1为以实施例1构建的表达载体制备的膜蛋白CD14抗体的WB验证结果图；图2为以实施例1构建的表达载体制备的膜蛋白CD14抗体的IF验证结果图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本专利技术的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本专利技术技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本专利技术的权利要求保护范围内。本专利技术的一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：步骤(1)：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，即获得膜蛋白CD14表达载体。步骤(2)中，通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游。β2微球蛋白基因能将不易表达的外源蛋白连接在β2m基因下游，能使外源蛋白高效表达。步骤(3)中，在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别用内切酶进行双酶切引入双酶切位点，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶将载体和目的片段进行连接，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。实施例1本专利技术的一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，包括以下步骤：步骤(1)：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫，在取小鼠脾脏前3d加强免疫一次，测定抗血清效价，取效价高的小鼠，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；扩增反应条件如下:94℃预变性5min，94℃45s，58℃1min，72℃45s，共进行30个循环，72℃延伸10min；步骤(2)：通过SOE-PCR方法或平端连接方法将助表达序列的基因连接到重链可变区的上游，将组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因连接到轻链可变区下游得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；PCR反应如下:首先在常规PCR反应体系(50μL)中加入等摩尔VL、VH基因,94℃预变性5min，94℃45s，68℃1min，72℃45s，共进行10个循环，72℃延伸10min；步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别用内切酶AgeI和NcoI进行双酶切引入酶切位点SfiⅠ和NotⅠ酶切位点，37℃过夜，载体pFUSEss-CHIg-hG1用同样的内切酶双酶切，然后用T4DNA连接酶将载体和目的片段进行连接，16℃下过夜，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，转化液涂布于含卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜，次日随机挑取8个平板上单克隆菌落进行菌落PCR，筛选阳性单克隆菌落，扩增提取得到pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒。表1核苷酸序列表实施例2通过实施例1构建的表达载体制备膜蛋白CD14抗体的方法如下：将获得的pFUSEss_CHIg重链表达质粒和pFUSE2ss_CLIg轻链表达质粒质粒混合，通过PEI缓释液转染至293T细胞中，转染前将293T细胞传代，保证细胞汇合度达到80％～85％，将DNA稀释液和PEI稀释液混合，静置5min后加入293T细胞中，放于37℃的二氧化碳培养箱中培养，转染48h取样检测抗体是否表达，根据检测情况确定收样时间；用抗性筛选含有两种质粒的细胞株293T细胞，培养细胞株后得到CD14抗体。1、通过ELISA检测293T细胞株以抗人KAPPA链抗体用包被酶标板，4℃包被过夜，5％牛奶封闭液封闭2h；，分别加入正常未转染293T细胞上清(-)和人IgG标准品(100ng/mL---+)和293T细胞表达上清本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss‑CHIg‑hG1上，即获得膜蛋白CD14表达载体。

【技术特征摘要】
1.一种制备膜蛋白CD14抗体的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)：以人外周血单核细胞(PBMC)为免疫原对小鼠进行免疫后，提取脾脏总RNA，在两端序列设计特异性引物，引物序列见核苷酸序列表，分别以引物VH对和引物VL对扩增重链可变区和轻链可变区；步骤(2)：将助表达序列的基因、组氨酸标签基因和β2微球蛋白基因分别连接到重链可变区和轻链可变区得到目的片段，所述助表达序列的基因序列见序列表1；步骤(3)：在重链可变区的上游和轻链可变区下游分别引入双酶切位点，通过PCR技术将目的片段克隆到载体pFUSEss-CHIg-hG1上，即获得膜蛋白CD1...

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，马峰，罗绍祥，肖颖，舒芹，徐春雷，王静，邓陈玲，易汪雪，李昆鹏，
申请(专利权)人：武汉金开瑞生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42