zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用，所述干扰片段的序列为GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。本发明专利技术的干扰片段通过对雄性犬的生殖细胞Y精子生成的相关基因进行沉默，阻碍或者破坏Y精子的正常发育和功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物分子遗传学
，尤其涉及一种zfy基因的RNA干扰片段、表达载体及其应用。
技术介绍
在自然条件下，几乎所有哺乳动物的性别比例都接近1:1，从而实现了无间断地进行稳定地繁衍后代，在自然的条件下达到生态平衡。对于畜牧生产实际而言，理想的性别比例具有十分重要的意义。利用泌乳、产蛋性状进行生产的生产企业希望得到更多的雌性个体，而产肉、产毛性状的在雄性个体上表现得优势性更加明显。一直以来，人类对控制动物后代的性别就有着极大的兴趣。目前性别控制主要从受精前和受精后两个方面进行，前者应用精子分离后再进行受精，使得在受精时就决定了后代的性别；后者采用早期胚胎性别鉴定，进行胚胎的性别筛选的方法来控制后代的性别。哺乳动物性别决定理论认为，性染色体为“XX”的受精卵就能够发育成雌性个体，而性染色体为“XY”的就会发育成雄性。那么从根本上讲，控制家畜性别最理想的方法是先分离X、Y精子，然后再进行受精，就能人为地控制后代的性别，理论上这是在性别控制中最简单、最经济的途径。自20世纪50年代后，关于精子分离的研究报告很多，这些研究都试图利用X精子和Y精子不同的物理特性(体积、密度、电荷、运动性))，采用离心法、电泳法、离子交换法、细胞表面抗原法等不同的方法来实现精子的分离，但是都有一个共同的问题——可重复性差。而且这些差异随着环境条件的不同而发生变化，因此，许多研究结果常常不一致，甚至出现相反的结论，致使两类精子某些差异性研究存在争议。到目前为止，除了X、Y精子DNA含量具有差异可以肯定之外，其他方面的差异表现很小，甚至难以确定。但是随着分子生物学技术的不断发展，以及研究工作的继续深入，新的研究成果将会不断涌现。目前根据哺乳动物X、Y精子DNA含量存在差异的原理，利用流动细胞检索仪进行分离X、Y精子，分离效果最好，纯度可达90％以上，但是由于设备昂贵，分离速度慢，用于受精的精子数量少、活力差等原因，远远不能满足生产上对性控精液的大量需求。相比之下，如果能够找到两种精子发育或受精过程中，甚至胚胎发育时关键性的X、Y染色体特异mRNA，结合当代新兴的分子生物学技术利用RNA干扰(RNAInterference，RNAi)的方法则有望以较低的成本，简便、快速地实现对动物的性别控制。RNAi是一种转录后的基因沉默(Post-transcriptionalGeneSilencing，PTGS)现象，通过体外人工合成或体内产生的双链RNA(Dubble-strandedRNA.dsRNA)在细胞内特异性地降解其同源的mRNA，使得相应的基因干扰，实现阻止目标基因的表达。RNAi方法能够快速、简便、有效、特异地下调细胞中的基因表达，它不但是研究基因功能的一种有力工具，而且也为特异性基因治疗提供了新的技术手段，其应用前景十分广阔。在基因组、mRNA和蛋白水平的研究都证明，X、Y精子基因表达的确存在差异。基因表达检测研究表明，在精子形成的减数分裂粗线期，为防止一些酶类与性染色体发生作用，两条性染色体高度浓缩形成性体。性体的形成保护了性染色体，性染色体上特殊基因的表达被关闭。因此，哺乳动物成熟精子中没有mRNA的转录，然而哺乳动物成熟精子中却含有mRNA，这种差异来自精子发生过程中的转录，其翻译远落后于转录。这些mRNA是精子成熟后指导合成一些必须的蛋白，或者是受精后对卵母细胞mRNA库的补充，或作为RNAi对生育和胎儿生长发育起着关键的作用。Hendriksen等对小鼠的研究发现，减数分裂过程中，除Xist基因表达外，几乎所有的性染色体基因都没有表达，然而减数分裂后期，一些性染色体特异基因开始表达。减数分裂后，检测到Y染色体上Ubely和Sry基因具有较高的mRNA水平；在X精子中也检测到Ubelx基因mRNA高水平表达，同时发现X染色体特异基因Mhr6A的表达产物。另外还有人发现X、Y染色体其他特异基因的表达，如X染色体特异基因Akap82(精子尾部的骨架蛋白)及Nap-X(编码一种核相关蛋白)，Y染色体特异基因Zfy-1、Zfy-2及Y353/B。其中Zfx/Zfy基因是染色体上编码锌指蛋白的一对等位基因，从减数分裂期开始表达，在圆形精子细胞中的含量最高。Zfx基因是ZFY(zincfinger-Y)基因家族中的一员，ZFY家族包括Zfx，Zfy和Zfa基因，他们在分子结构上非常相似。一般哺乳动物有Zfx和Zfy基因,Zfx基因位于X性染色体上,是雌、雄性哺乳动物X染色体必含的基因,Zfy基因位于Y性染色体上，两个基因位于性染色体的末端，但并不位于同源区域。Zfx基因包括一个酸性的转录激动区域，一个核定位序列和一个DNA连接区，具有13个C2H2[Cys(2)His(2)]型锌指结构。在哺乳动物细胞中，C2H2锌指结构是最常见的蛋白质结构之一。目前已发现800多种具有这种锌指结构的蛋白质，具有重要的生理功能。Zfx/Zfy编码的蛋白作为转录因子，在精子形成过程中具有一些功能并与精子的发生有关。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术实施例提供一种zfy基因的RNA干扰片段，主要目的是通过对雄性犬的生殖细胞Y精子生成的相关基因进行沉默，阻碍或者破坏Y精子的正常发育和功能。为达到上述目的，本专利技术主要提供如下技术方案：一方面，本专利技术实施例提供了一种zfy基因的RNA干扰片段，其序列为GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。另一方面，本专利技术实施例提供了一种上述实施例所述的zfy基因的RNA干扰片段在控制犬子代性别中的应用。作为优选，上述的应用中，以zfy基因的RNA干扰片段对犬精子细胞中的Y精子生成相关基因进行沉默，产生特定类型的精子细胞。另一方面，本专利技术实施例提供了一种表达载体，所述表达载体克隆有上述实施例所述的zfy基因的RNA干扰片段。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术实施例提供的zfy基因的RNA干扰片段通过对雄性犬的生殖细胞Y精子生成的相关基因进行沉默，阻碍或者破坏Y精子的正常发育和功能。在与雌性犬交配时给与了X精子更多的受精机会，在受精前有效的控制了犬的性别从而使子一代犬产生的雌犬率大大升高。本方法对所需精子细胞不会造成损伤或者降低其活力，而且成本低廉。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步详细描述，但不作为对本专利技术的限定。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构、或特点可由任何合适形式组合。构建zfy基因的RNAi干扰载体：所使用的zfy基因序列来自于NCBI基因库，根据RNAi设计原则和在NCBI上的比对分析结果筛选出4个siRNA片段，如表1所示，为siRNA体外转录的zfycDNA模板。分别在每个siRNA片段的5’和3’添加HpaI和XholI酶切位点，参见表3所示，然后送生物公司合成siRNA片段。正、反义链通过退火合为双链连接到RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreenVector(Clontech，美国)载体上，然后转化到E.coliDH5α感受态细胞中(Tiangen,中本文档来自技高网...

【技术保护点】
zfy基因的RNA干扰片段，其特征在于，其序列为GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。

【技术特征摘要】
1.zfy基因的RNA干扰片段，其特征在于，其序列为GCAAGAACTTTCCTCATAT、GACAGCTGAACAAGGCTTA、GAAGTCATCAAGGTATACA或GGATGAAGATGAACTTGCA。2.权利要求1所述的zfy基因的RNA干扰...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾斌，纪俊明，张永生，
申请(专利权)人：石河子大学，
类型：发明
国别省市：新疆;65