一种链霉菌重组表达载体的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种链霉菌重组表达载体的构建及应用，属于基因工程领域。本发明专利技术提供的链霉菌表达载体，方便外源基因的插入及防止转录通读在载体上添加多克隆位点和终止子，且能够在三种链霉菌中大量分泌表达TGase。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于基因工程领域。
技术介绍
链霉菌属革兰氏阳性细菌，作为基因工程受体菌有其自身的优越性：首先，利用链 霉菌进行工业化规模生产抗生素的历史悠久，在工业规模发酵技术方面已积累了相当丰富 的经验，因而可利用现有的技术及设备生产链霉菌表达的外源基因产物：其次，链霉菌相比 于枯草芽孢杆菌产生的胞外酶较少，可防止外源蛋白被降解。胞外分泌系统发达，可用于外 源基因的分泌表达，简化外源基因产物的分离和纯化；同时，对链霉菌的分子遗传学研宄的 长足进展，特别是有关链霉菌质粒的分子生物学、链霉菌启动子、链霉菌蛋白质分泌的信号 序列等方面研宄的综合进展。给外源基因在链霉菌中的表达提供了理论基础。在链霉菌中 表达的蛋白质常常是可溶性的，因此就无需为了获得具有生物活性的蛋白质而使表达的蛋 白重新溶解并折叠成正确的构型；最后，链霉菌作为基因表达的受体，其致病性小。链霉菌 成为继大肠杆菌、枯草芽孢杆菌之后又一个有价值的基因表达的宿主菌。 已有大量有关真核基因及一些非链霉菌来源的原核基因在链霉菌中表达的报道。 如人膜岛素Glucagon(Qi.etal.，J.Microbiol.Biotechnol，2008, 1076 - 1080.)，曲霉木 聚糖酶Xylanase(Diazetal.，2〇04,Appl.Microbiol.Biotechnol.，401 - 4〇6.)，链球菌 溶检酶streptokinase(Pimientaetal.，2007,Microb.CellFact. 6,20.) 〇 虽然链霉菌的克隆体系已建立得较为完善，然而能与大肠杆菌操作中相比拟的用 于基因表达的启动子和载体还很有限。因此，探索发现新型启动子并构建表达载体，对于拓 展链霉菌表达系统很有意义。 本专利技术提供的链霉菌表达载体，方便外源基因的插入及防止转录通读在载体上添 加多克隆位点和终止子，且能够在三种链霉菌中大量分泌表达TGase。
技术实现思路
本专利技术以载体pISG86(SEQIDNO. 3)为出发载体，在其上设计连接了序列如SEQ IDNO. 1所示的启动子及信号肽、序列如SEQIDNO. 2所示的多克隆位点及终止子，构建了 链霉菌高效分泌表达载体。 本专利技术还提供一种构建所述分泌表达载体的方法，主要包括以下步骤： (1)扩增启动子及信号肽序列后通过KpnI、BglII双酶切处理，并连接至相同酶切 处理后的载体PISG86,得到pISG86-l; (2)以序列如SEQIDNO. 6、7所示的引物，以pISG86-l为模板，通过重叠PCR将多 克隆位点序列及终止子序列连接至PISG86-1的信号肽下游，获得序列正确的载体pSGOl; 以pSGOl为模板，分别以序列如SEQIDNO. 8、9所示的引物对，序列如SEQIDN010、ll所 示的引物对，进行PCR，对pSGOl经密码子优化得到链霉菌高效分泌表达载体pSG02。 本专利技术提供的表达载体，在表达外源蛋白TGase时，与链霉菌内常用的强启动子 红霉素启动子potE#相比，表达量更高，说明该启动子可作为一种强启动子在链霉菌内表达 其他外源蛋白。此外，本专利技术构建的载体可以在S.lividansTK24，S.lividans1326及 5. griseus内成功表达TGase，说明该表达载体具有在这三种链霉菌中表达其他外源蛋白 的潜力。【附图说明】 图lpSG02-TGase在链霉菌S.lividans1326中表达的蛋白电泳图谱，（a) pSG02-TGase在链霉菌S.lividans1326中表达的蛋白电泳图谱，（b)pSG03-TGase在链霉 菌S.lividans1326中表达的蛋白电泳图谱。 图2pSG02_TGase在三种链霉菌中的表达。 图3苯丙氨酸脱氨酶、氨肽酶通过pSG02在S.lividansTK24内表达的蛋白电泳 图谱；(a)氨肽酶，（b)苯丙氨酸脱氨酶。【具体实施方式】 以下实施例涉及的有关方法： TGase酶活测定方法：比色法测定酶活。用a-N-CBZ-Gln-Gly为作用底物，L-谷 氨酸-Y-单羟胺酸做标准曲线。1个单位TGase酶活定义为：37°C每分钟催化底物形成 1ymolL-谷氨酸-y-单轻胺酸的酶量（U/mL)。酶活测定条件：37°C条件下反应lOmin。 苯丙氨酸脱氨酶（PAL)酶活测定方法：取适量发酵上清与225yL的Tris-HCL buffer(25mM，pH8. 0)、250yL底物L-苯丙氨酸混合，反应总体积为500yL。40度反应 30min，加500yL甲醇终止反应。酶活单位定义：40°C每分钟生成ImM的反式肉桂酸需要的 酶量为一个酶活单位。 氨肽酶（BSAP)酶活测定方法：取适量发酵上清与4mmol/L的底物 aminoacyl-p-nitroanilines混合，37°C反应10min，405nm下测定吸光值，酶活单位定义： 37度每分钟形成1ymol对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。实施例 1 载体pSG02_TGase和pSG03_TGase的构建 设计引物（P1/P2)扩增启动子信号肽序列后酶切（KpnI/Bglll)连接至载体 PISG86 ;在此基础上通过全质粒PCR的方法（P3/P4)将MCS和fd-ter插入到信号肽的下 游。之后利用定点突变（P5/P6)将信号肽序列中的第7位的亮氨酸稀有密码子TTA突变 为CTG，第21位氨基酸丝氨酸的编码基因AGC突变为GCC(P7/P8)，获得载体pSG02,大小为 6. 6kb。以S.hygroscopicusWSH03-13基因组为模板，设计引物获得TGase基因片段，通过 酶切连接至PSG02,获得TGase表达载体pSG02-TGase。以载体pISG86为模板，通过PCR方 法（P9/P10)获得POTn^启动子片段，通过全质粒PCR的方法以P^启动子替换pSG02的启 动子，并连接TGase基因获得载体pSG03_TGase。 P1 :5, -CGGGGTACCGCCAGGAGCAGGGGAACGC-3， P2 :5, -GAAGATCTGGCATGGCTGACCGACGGC-3， P3 ： 5?-GGAGTCATGCCGTCGGTCAGCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCCGTTAACAAGCTTCCCGGGTAA ACCGATACAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTGGAGTCACGCGCCCAACGGCGGCG-3'P4 ： 5 '-GGGCCCACGCCGCCGTTGGGCGCGTGACTCCAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCCTTTAATTGTA TCGGTTTACCCGGGAAGCTTGTTAACGGATCCTTTAAAATCGATGGCATGGCTGACCGACGGC-3' P5 ：5, -GGAGTCATGCCGTCGGTCGCCCATGCCATCGATTTTAAAGGATCC-3 , P6 :5, -CCTTTAAAATCGATGGCATGGGCGACCGACGGCATGACTCCAGCGGTG-3' P7 :5' -ATGTACAAGCGTCGGAG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种链霉菌重组分泌表达载体，其特征在于，以核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的载体pISG86为出发载体，在其上设计连接了序列如SEQ ID NO.1所示的启动子及信号肽、序列如SEQ ID NO.2所示的多克隆位点及终止子，构建了链霉菌高效分泌表达载体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周哲敏，关成冉，崔文璟，周丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32