羊驼MC1R转基因表达载体及其构建和应用制造技术

本发明专利技术公开了一种羊驼

【技术实现步骤摘要】
羊驼MC1R转基因表达载体及其构建和应用
本专利技术属于生物工程
，涉及一种由羊驼MC1R转基因克隆得到的MC1R表达载体，以及所述表达载体的构建和应用。
技术介绍
对于哺乳动物而言，黑素皮质素受体-1(MC1R)基因和编码Agouti蛋白的基因是影响真黑素和褐色素分布及数量多少的主要基因。MC1R存在于成熟黑色素细胞表面，黑素皮质素激素(α-melanocytestimulatinghormone，α-MSH)是它的天然配体。α-MSH是一种神经内分泌激素，由13个氨基酸组成，是由POMC生成，能加快黑色素细胞的分裂。角质化细胞也会合成α-MSH，可能是黑素细胞生长的“纯天然”因子。MC1R与α-MSH的亲和力最高，两者合在一起后可激活黑色素细胞接受机体激素调控的主要信号通路，即cAMP信号通路，在动物被毛颜色形成过程中发挥关键作用。而ASP(Agouti信号蛋白)可降低α-MSH与MC1R的结合，影响cAMP信号通路，使cAMP合成减少，进而导致褐色素的生物合成增加，造成动物被毛表型呈黄色。所以，MC1R是控制毛色形成的主要基因，MC1R能够调控α-MSH-MC1R信号转导路经，引起信号转导路径变化，影响哺乳动物毛色的形成。真黑素和褐黑素都来自共同的酪氨酸酶依赖性途径，拥有相同的前体——酪氨酸。二者由酪氨酸酶催化酪氨酸羟化形成多巴醌的过程是一致的，且该过程中也有衍生物左旋多巴生成。在多巴醌以后，褐黑素和真黑素开始分为两条途径各自合成。多巴醌自身稳定性差，会通过分子内环化作用成为环化多巴，然后很快会被氧化为多巴色素。多巴色素通过脱羧基重排反应生成DHI。多巴色素会在酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)的催化下形成5,6-二羟吲哚-2-羧酸(DHICA)，经下一步氧化反应生成真黑素聚合物，动物毛色因而表现为黑褐色。其中两种酶决定了真黑色素的生成，分别为酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1)(糖蛋白75或b位点)和酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)。TRP1、TRP2同色氨酸组分有40～45%的一致性，因此TRP1、TRP2可作为分化标记。褐黑素的形成过程中有半胱氨酸(CyS)和谷胱苷肽(Glu)参与，多巴醌和半胱氨酸会先形成5-S-半胱氨酸多巴异构体，随后经氧化还原反应形成醌类混合物，最终转化为褐黑素，动物毛色呈现黄红毛色。小眼畸形相关转录因子(MITF)基因在色素细胞、肥大细胞、破骨细胞等的发育、分化过程中发挥着重要作用，特别在色素细胞中更是意义重大。MITF基因会调控酪氨酸基因家族的表达，如TYR、TYRP1、TYRP2基因的启动子中包含有“Mbox”这一共同结构。这个结构的核心序列为“CATGTG”。MITF会通过这个“Mbox”调控TYR、TYRP1、TYRP2基因的表达。这些基因与黑色素细胞中黑素生成密切相关，MITF就是通过这一途径调节黑色素细胞的色素沉积、分化、增殖和存活。MITF不仅是黑色素细胞发育过程中的重要调节因子，而且在维持黑色素干细胞方面也发挥着至关重要的作用。MITF会促进作为生物合成黑素的主要酶——酪氨酸酶的转录，酪氨酸酶在毛色通路上负责催化酪氨酸形成多巴，进而转化为多巴醌的过程，最终启动黑色素的合成过程。因此，MITF是真黑素和和褐色素的形成过程中的重要转录调控因子。羊驼的22种毛色性状均能稳定遗传，从转基因动物遗传资源角度看，羊驼是最理想的毛色性状基因的供体。针对羊驼MC1R基因与羊驼毛色的研究结果表明，不同毛色羊驼的MC1R基因和蛋白的表达水平存在显著差异，即羊驼MC1R基因的表达水平决定着羊驼的毛色。绵羊是我国重要的毛用型经济动物，毛纤维是毛纺织工业的重要原料。培育毛色转基因绵羊，可望提高我国羊毛的综合竞争力，带来巨大的生态效益、经济效益和社会效益，对提高我国羊毛及其制品的内在品质和国际竞争力、提高养羊业和毛纺织业的经济效益以及促进农牧区农村经济发展等具有重大意义。但到目前为止，还没有最适宜的羊驼MC1R转基因表达载体供转基因绵羊所用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能够供转基因绵羊所用的适宜的羊驼MC1R转基因表达载体。提供所述羊驼MC1R转基因表达载体的构建方法和应用，是本专利技术的另一专利技术目的。本专利技术提供的羊驼MC1R转基因表达载体包括有慢病毒载体，以及连接在所述慢病毒载体上的SEQIDNO.3所示核苷酸序列的羊驼MC1R基因克隆质粒。其中，所述的慢病毒载体为pLV.ExBi.P。所述慢病毒载体pLV.ExBi.P由羊驼生物工程实验室提供，载体上带有绿色荧光。本专利技术所述羊驼MC1R转基因表达载体的具体构建方法是：利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的非特异性引物，从羊驼cDNA中扩增羊驼MC1R基因，与pMD18-TVector载体连接，转化DH5α感受态细胞，培养阳性克隆，得到SEQIDNO.3所示的羊驼MC1R基因克隆质粒；以内切酶SalI和XbaI对慢病毒载体pLV.ExBi.P和所述羊驼MC1R基因克隆质粒进行双酶切，连接后转化感受态细胞DH5α，培养并提取质粒，得到所述羊驼MC1R转基因表达载体。本专利技术将所获得的羊驼MC1R基因连接到慢病毒载体pLV.ExBi.P中，构建成MC1R慢病毒表达载体pLV.ExBi.P-MC1R，经测序正确后将该表达载体转染到绵羊黑色素细胞，使其在绵羊黑色素细胞中特异表达。通过荧光定量PCR和Westernblot技术，从基因和分子水平证明该表达载体在绵羊黑色素细胞中的生物性效应体现为对绵羊黑色素细胞中黑色素形成的关键基因MITF、TYRT、YPR2和MC1R的表达有上调作用，并使黑色素产量明显提高。说明本专利技术所构建的pLV.ExBi.P-MC1R表达载体对黑色素的形成起到了促进作用，可用于转基因绵羊的生产实践，为生产表达羊驼毛色的转基因绵羊奠定基础。具体地，是将羊驼MC1R基因构建到pLV.ExBi.P慢病毒载体中，并在所述慢病毒载体中连接哺乳动物黑色素细胞中特异表达的基因TRP2的启动子，通过精原干细胞注射法将其导入绵羊睾丸中，使子代绵羊的毛色发生变化。通过上述转基因技术，能够培育出具有天然色彩毛色的绵羊，既可降低后期毛色染色漂洗等流程的成本，又减少污染，绿色环保，同时也提升了羊毛的价值。附图说明图1是pLV.ExBi.P-MC1R表达载体在黑色素细胞中的转染结果。图2是pLV.ExBi.P-MC1R表达载体对绵羊黑色素细胞中MC1R、MITF、TYR及TYRP2在mRNA表达水平的影响。图3是pLV.ExBi.P-MC1R表达载体对绵羊黑色素细胞中MITF、TYR及TYRP2在蛋白水平表达的影响。图4是pLV.ExBi.P-MC1R表达载体对绵羊黑色素细胞黑色素产量的影响。具体实施方式以下结合具体实施例对本专利技术作进一步的详细说明。实施例1：羊驼MC1R基因的克隆。1、提取羊驼皮肤组织总RNA，反转录合成cDNA。2、根据NCBI上羊驼MC1R（GenBank：FJ517582.2）的基因序列，利用primerpremier5.0设计非特异性引物，由cDNA扩增包含完整羊驼MC1RCDS区的MC1R基因，引物序列设计如下：Forwardprimer(5'-3)'：ACGCGTCGACAGACCCTTTCCTGC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种羊驼

【技术特征摘要】
1.一种羊驼MC1R转基因表达载体，包括慢病毒载体及连接在所述慢病毒载体上的SEQIDNO.3所示核苷酸序列的羊驼MC1R基因克隆质粒。2.根据权利要求1所述的羊驼MC1R转基因表达载体，所述的慢病毒载体为pLV.ExBi.P。3.权利要求1所述羊驼MC1R转基因表达载体的构建方法，是利用SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的非特异性引物，从羊驼cDNA中扩增羊驼MC1R基因，与pMD18-TVector载体连接，转化DH5α感受态细...

【专利技术属性】
技术研发人员：任玉红，范瑞文，张秋月，曾庆宝，郝晓娟，武良琦，张一诺，
申请(专利权)人：山西农业大学，
类型：发明
国别省市：山西,14