表达载体及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种表达载体，以pPICZαA载体为骨架携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。本发明专利技术还提供了表达载体的构建方法，包括将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA‑YPSΔ；将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA‑PDI；以重组载体pPICZαA‑PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA‑YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA‑PDI‑YPSΔ。本发明专利技术还提供了表达载体在表达外源蛋白中的用途，以及外源蛋白的表达方法。

【技术实现步骤摘要】
表达载体及其构建方法与应用
本专利技术属于生物工程领域，具体地，本专利技术涉及一种表达载体及其构建方法与应用，更具体地，本专利技术涉及一种共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的表达载体及其构建方法与应用。
技术介绍
随着生物技术的发展，利用基因工程技术来开发重组蛋白已颇受人们青睐。毕赤酵母表达系统是当前流行的真核表达系统之一，具有许多其他蛋白表达系统所不具备的优点，有可诱导的强启动子，外源基因能整合于染色体上，具有高表达、高稳定、高密度发酵、适度糖基化、表达产物生物活性好、操作简便及易于工业化生产等特点，已成功地表达了许多极具价值的蛋白。但是不同的蛋白在毕赤酵母表达过程中表现出不同的表达量，有的蛋白难于在毕赤酵母中表达，而有的蛋白表达量可达10g/L以上，因此，分泌表达量成为制约毕赤酵母表达的瓶颈，如何提高产量，降低生产成本，是目前的研究热点。有研究发现，外源蛋白的分泌表达量低往往是其在内质网中的聚集造成的。通过采用不同启动子或增加基因拷贝数的策略来增强毕赤酵母表达外源蛋白，相当含量的外源蛋白因未进行正确的折叠加工，仍然滞留在胞内而未被分泌表达，因此外源蛋白在内质网中的有效折叠和整合一定程度上影响了外源蛋白的总产率。利用共表达分子伴侣如蛋白二硫键异构酶(Proteindisulfideisomerase,PDI)能够有效改善这一状况，使外源蛋白的分泌效率有效提高。另外，外源蛋白在表达过程中的降解也是影响分泌表达量的一个重要因素，YPS1蛋白酶是一类糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的天冬氨酸蛋白酶，能特异性地切割底物中的单或双碱性氨基酸残基位点，起着加工前肽的作用，但YPS1也在外源蛋白的表达过程中起到降解外源蛋白的作用，如人血清白蛋白(HSA)在毕赤酵母表达过程中产生的45KD降解片段，有报道称降解是由YPS1蛋白酶引起。在同一毕赤酵母菌株中共表达外源目的蛋白和分子伴侣二硫键异构酶(PDI)，同时失活YPS1基因，目前常用的方法为分别构建不同的载体，包括外源蛋白表达载体、过表达二硫键异构酶载体和YPS1失活载体，并需分别进行转化筛选，过程繁琐复杂，还需考虑采用不同的筛选标记，筛选周期长，所以亟需设计构建一种在同一载体实现外源蛋白和二硫键异构酶共表达，同时失活YPS1基因的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中的如下缺陷提出的解决技术方案：现有技术中为了实现多基因共表达，目前常用的方法为分别构建不同的载体，并需分别进行转化，选择不同的筛选标记进行筛选，过程较繁琐复杂，筛选周期长。具体地，针对上述缺陷，本专利技术提供了一种共表达二硫键异构酶同时失活YPS1基因的表达载体，该载体的构建方法，该载体在表达外源蛋白中的用途，以及外源蛋白的表达方法。一方面，本专利技术提供了一种表达载体，以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。前述的表达载体，所述PDI表达盒是序列表中SEQIDNo:3的核苷酸序列。前述的表达载体，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQIDNo:1的核苷酸序列。前述的表达载体，所述PDI表达盒连接在所述pPICZαA载体的BglII位点。前述的表达载体，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列连接在所述pPICZαA载体的BamHI位点。前述的表达载体，所述表达载体在毕赤酵母中进行表达。另一方面，本专利技术提供了前述的表达载体的构建方法，包括以下步骤：(1)将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，筛选获得重组载体pPICZαA-YPSΔ；(2)将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI；(3)以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；(4)将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。前述的构建方法，在步骤(1)之前，以毕赤酵母基因组DNA为模板，以C端非功能区序列引物YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端非功能区序列，以N端非功能区序列引物YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端非功能区序列；其中：YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’YPS-c-R：5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’YPS-N-F：5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’YPS-N-R：5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’。前述的构建方法，在步骤(1)中，YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体的BamHI位点。前述的构建方法，在步骤(2)中，以PDI基因序列为模板，设计引物，在上游引物添加Bsp119I限制性内切酶位点，下游引物添加XbaI限制性内切酶位点，经PCR获得PDI基因片段后，再经Bsp119I和XbaI双酶切，连接至pPICZαA表达载体中，获得pPICZαA-PDI载体，其中：上游引物PDI-bspU：5'-GCGTTCGAAATGCAATTCAACTGGAATAT-3'下游引物PDI-xbaL：5'-CCGTCTAGATTAAAGCTCGTCGTGAGCGTCT-3'。前述的构建方法，在步骤(3)中，PCR采用的引物是：PDI-EG-F:5'-ttggtcatgagatcagatctAACATCCAAAGACGAAAGGTTG-3'PDI-EG-R:5'-cgtctttggatgttagatctGCACAAACGAAGGTCTCACTTA-3'。前述的构建方法，在步骤(4)中，PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ的BglII位点。另一方面，本专利技术提供了前述的表达载体在表达外源蛋白中的用途。前述的用途，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。另一方面，本专利技术提供了一种外源蛋白的表达方法，包括：将外源蛋白基因连接至前述的表达载体，筛选获得重组表达载体，并在毕赤酵母中表达所述重组表达载体。前述的表达方法，包括如下步骤：(1)将外源蛋白基因标记为insert，以外源蛋白基因序列为模板，设计引物，在上游引物中添加XhoI酶切位点CTCGAG，同时在XhoI酶切位点后添加AAAAGA，在下游引物中添加NotI限制性酶切位点GCGGCCGC，经PCR获得目的基因；(2)将步骤(1)获得的目的基因与前述的表达载体进行XhoI和NotI双酶切，并连接，转化大肠杆菌，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert；(3)对步骤(2)获得的表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ-insert在YPS1的C端和N端非功能区序列之间进行EcoRI线性化，YPS1的C端和N端序列作为同源重组交换同源臂，经电转化插入毕赤酵母基因组；(4)Zeocin筛选与外源蛋白表达。前述的表达方法，所述外源蛋白是人血清蛋白、人生长激素或人表皮生长因子。本专利技术的有益技术效果：利用pPICZαA-PDI-YPSΔ载体表达外源蛋白，节约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达载体，其特征在于，以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达载体，其特征在于，以pPICZαA载体为骨架，携带PDI表达盒，以及YPS1基因C端和N端非功能区序列。2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI表达盒是序列表中SEQIDNo:3的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列是序列表中SEQIDNo:1的核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述PDI表达盒连接在所述pPICZαA载体的BglII位点。5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述YPS1基因C端和N端非功能区序列连接在所述pPICZαA载体的BamHI位点。6.根据权利要求1-5任一项所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体在毕赤酵母中进行表达。7.权利要求1-6任一项所述的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-YPSΔ；(2)将PDI基因序列连接至pPICZαA载体，获得重组载体pPICZαA-PDI；(3)以重组载体pPICZαA-PDI为模板通过PCR获得PDI表达盒；(4)将PDI表达盒连接至重组载体pPICZαA-YPSΔ，筛选获得表达载体pPICZαA-PDI-YPSΔ。8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)之前，以毕赤酵母基因组DNA为模板，以C端非功能区序列引物YPS-C-F与YPS-C-R为引物，利用高保真酶PCR获得C端非功能区序列，以N端非功能区序列引物YPS-N-F与YPS-N-R为引物，利用高保真酶PCR获得N端非功能区序列；其中：YPS-C-F：5’-accttcgtttgtgcggatccCTCCTATGATTCGTCAAGACAA-3’YPS-c-R：5’-ctggctgagcggaaaGAATTCACTATACACACGCCGA-3’YPS-N-F：5’-gtgtatagtgaattcTTTCCGCTCAGCCAGATTTTAT-3’YPS-N-R：5’-ctatggtgtgtgggggatccAACTAGTGCTAGTTCCAACGAG-3’。9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(1)中，YPS1基因C端和N端非功能区序列连接至pPICZαA载体的BamHI位点。10.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤(2)中，以PD...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯增淼，李晓颖，杨小琳，赵金礼，
申请(专利权)人：陕西慧康生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：陕西,61