一种I‑IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种I‑IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法及其应用，通过合成酵母表达密码子优化及特殊设计间隔串联序列的四型登革病毒基因，使用PichiaPink™ Expression System表达系统表达、Ni亲和层析柱纯化该重组串联蛋白，并利用酶联免疫吸附测定检测其抗原性，最终得到能同时针对四种血清型登革病毒的候选I‑IV型重组亚单位融合蛋白。本发明专利技术是针对登革病毒EDⅢ合成酵母表达系统人工优化的重组蛋白基因，其中同时整合了四种登革病毒血清型的EDⅢ基因，并且人工设计了连接肽基因序列，相应基因表达的重组融合蛋白免疫后将对多型登革病毒具有保护作用，作为I‑IV型登革病毒候选疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法及其应用
本专利技术属于病毒疫苗研发制造
，具体涉及一种I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法及其应用。
技术介绍
登革病毒颗粒含脂蛋白包膜，包括包膜蛋白(Envelope，E)和膜蛋白(Membrene，M)，继而形成包膜刺突。其中E蛋白是病毒包膜的主要糖蛋白，分子量约51～60KD，含有多种B细胞和T细胞抗原表位以及属特异、型特异等相关功能决定簇。同时还具有多种生物学功能，如结核靶细胞表面受体、介导膜融合、诱导产生中和抗体、红细胞凝集等。E蛋白包括三个结构域，以往有研究者将EDⅠ和EDⅡ联合用大肠杆菌表达，并检测证明有良好的免疫原性。但是随着人们对蛋白的深入研究，EDⅢ区相比起其他两个结构域显示出了更大的优势，主要表现在EDⅢ的免疫球蛋白样结构使其具备与细胞结合的功能；EDⅢ独立于E蛋白其他结构域，垂直伸出病毒表面形成突起。这样的结构特征使该结构域可能是病毒与受体结合的主要部位。除此以外，EDⅢ是E蛋白的毒力决定簇之一，其包含能诱导产生特异性中和抗体的型和亚型抗原表位。所以，EDⅢ蛋白的表达可以为以后的实验奠定良好的基础，起着尤为重要的作用。登革病毒(Denguevirus，DV)分为四种血清型别(DVⅠ/DVⅡ/DVⅢ/DVⅣ)，部分感染者感染病毒后会出现登革热(Denguefever，DF)，登革出血热(Denguehemorrhagicfever，DHF)和登革休克综合征(Dengueshocksyndrome，DSS)等临床表现。研究证明，引起登革出血热及登革休克综合征的一个重要的原因可能是抗体依赖增强感染效应(Antibody-dependentenhancement，ADE)，即感染某一型的登革病毒后产生的亚中和抗体，经过一段时间后，当病人再感染异型病毒时不但没有中和病毒的效果，还介导病毒的复制扩增过程，最终使病情加重。登革热疫苗的研究已经有70多年的历史，ADE问题一直困扰着研究者们，成为登革热疫苗研究中的一个重要瓶颈。考虑到这一关键问题，本专利技术将四种血清型的登革病毒EDⅢ串联起来，表达一个亚单位串联重组蛋白，同时具有四种血清型的登革病毒的免疫原性，能为机体同时提供多种登革病毒的保护性，为登革病毒疫苗的开发奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于获得一种I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法及其应用，能作为有效的登革病毒候选疫苗。其中使用真核表达系统表达人工设计串联及真核表达密码子优化的EDⅢ蛋白，产量更高。另外，与原核表达系统相比，蛋白能得到更完善的翻译后修饰，使重组的EDⅢ保真度更高，免疫原性得到完善保留，不被破坏。本专利技术通过下列技术方案实现：一种I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法，其特征在于经过下列各步骤：(1)将I-IV型登革病毒基因序列经SWISS-MODEL预测排列顺序，以柔性短肽基因(SEQIDNo.1)串联，经过酵母偏爱密码子优化得到串联基因序列；(2)在步骤(1)所得串联基因序列的5’端加入Kozak序列(SEQIDNo.2)以提高蛋白翻译效率，在3’端加入肠激酶基因(SEQIDNo.3)和组氨酸标签序列(SEQIDNo.4)，使重组蛋白具有可剪切的纯化标签，在末端引入终止密码子序列(SEQIDNo.5)终止蛋白翻译；然后通过PCR扩增，并在序列两端引入限制性内切酶位点EcoRI/SphI，进行双酶切，将其克隆至质粒pPink-HC，并转化入PichiaPinkTMExpression系统中的毕赤酵母菌株；通过甲醇诱导表达，组氨酸蛋白纯化获得I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白(SEQIDNo.9)。所述步骤(1)的I-IV型登革病毒基因序列是：Ⅰ型登革病毒标准株EF508198.1、Ⅱ型登革病毒标准株EU249523.1、Ⅲ型登革病毒标准株GU721069.1和Ⅳ型登革病毒标准株EF436282.1。所述步骤(1)的排列顺序为Ⅱ型-Ⅰ型-Ⅲ型-Ⅳ型。所述步骤(2)的PCR扩增的引物为：正向引物X1kozak—5’gcgaattcgccaccatgacaggtaaatt3’(SEQIDNo.7)反向引物X2End—5’ggcatgcttattagtggtgatggtggtgatg3’(SEQIDNo.8)所得Ⅰ-Ⅳ型登革病毒株的EDⅢ抗原重组蛋白可应用于登革病毒四联疫苗。所述登革病毒四联疫苗是，以氢氧化铝佐剂为佐剂，将所得I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白和氢氧化铝佐剂按体积比1:1配合。本专利技术具备的优点和效果：本专利技术是基于四种血清型登革病毒包膜蛋白结构域Ⅲ基因序列进行I-IV型串联EDⅢ重组亚单位疫苗的设计及构建。在设计过程中加入了酵母表达密码子优化方案以及特殊设计的间隔串联序列，该方案设计的四种血清型登革病毒(DV-I/DV-II/DV-Ⅲ/DV-IV)包膜蛋白结构域Ⅲ区串联基因在PichiaPinkTMExpressionSystem表达系统获得高效表达，经Ni亲和层析柱纯化获得纯化的重组串联蛋白，经小鼠免疫试验证明该I-IV型重组亚单位融合蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。EDⅢ是登革病毒中能引起有机体效免疫，且副作用又小的蛋白区段。本专利技术是针对登革病毒EDⅢ合成酵母表达系统人工优化的重组蛋白基因，其中同时整合了四种登革病毒血清型的EDⅢ基因，并且人工设计了连接肽基因序列，相应基因表达的重组融合蛋白免疫后将对多型登革病毒具有保护作用，可作为I-IV型登革病毒候选疫苗。附图说明图1为SWISS-MODEL预测重组EDⅢ空间结构；图2为重组EDⅢ序列预测结构时的Z-Score；图3为PichiaPinkTMExpressionstrain1MD培养结果；图4为实施例PCR扩增串联重组EDⅢ基因核酸电泳图，图中maker：DNAladder；1：引入了EcorI、Kozak序列、肠激酶酶切位点、6*His的重组蛋白EDⅢ序列的基因片段；2：引入了EcorI酶切位点、Kozak序列、肠激酶酶切位点、6*His、终止密码子以及SphI酶切位点的重组蛋白EDⅢ序列的基因片段；图5为实施例酶切鉴定pPink-HC-EDⅢ，图中maker：DNAladder；2,3：阳性pPink-HC-EDⅢ质粒，均包括目的条带1311bp及pPink-HC质粒条带7.7kb图6为实施例电转化成功的PichiaPinkTMExpressionstrain1；图7为实施例诱导表达的重组EDⅢ蛋白时菌体总蛋白考马斯亮蓝染色结果,图中make：ProteinLadder；1-1/1-2/1-3：单克隆1号24h、48h、72h时收获菌体蛋白；2-1/2-2/2-3：单克隆2号24h、48h、72h时收获菌体蛋白；3-1/3-2/3-3/3-4：单克隆3号24h、48h、64h、72h时收获菌体蛋白；图8为实施例筛选高效表达EDⅢ蛋白的表达酵母菌株western-blot免疫印迹检测结果，图中1-1/1-2/1-3：单克隆1号24h、48h、72h时收获菌体蛋白；2-1/2-2/2-3：单克隆2号24h、48h、72h时收获菌体蛋白；3-1/3-2/3-3/3-4：单克隆3号24h、48h、64h、72h本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种I‑IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）将I‑IV型登革病毒基因序列经SWISS‑MODEL预测排列顺序，以柔性短肽基因串联，经过酵母偏爱密码子优化得到串联基因序列；（2）在步骤（1）所得串联基因序列的5’端加入Kozak序列，在3’端加入肠激酶基因和组氨酸标签序列，在末端引入终止密码子序列终止蛋白翻译；然后通过PCR扩增，并在序列两端引入限制性内切酶位点EcoRI/SphI，进行双酶切，将其克隆至质粒pPink‑HC，并转化入PichiaPink™ Expression系统中的毕赤酵母菌株；通过甲醇诱导表达，组氨酸蛋白纯化获得I‑IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法，其特征在于经过下列各步骤：（1）将I-IV型登革病毒基因序列经SWISS-MODEL预测排列顺序，以柔性短肽基因串联，经过酵母偏爱密码子优化得到串联基因序列；（2）在步骤（1）所得串联基因序列的5’端加入Kozak序列，在3’端加入肠激酶基因和组氨酸标签序列，在末端引入终止密码子序列终止蛋白翻译；然后通过PCR扩增，并在序列两端引入限制性内切酶位点EcoRI/SphI，进行双酶切，将其克隆至质粒pPink-HC，并转化入PichiaPink™Expression系统中的毕赤酵母菌株；通过甲醇诱导表达，组氨酸蛋白纯化获得I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白。2.根据权利要求1所述的I-IV型串联登革病毒EDⅢ重组蛋白的构建方法，其特征在于：所述步骤（1）的I-IV型登革病毒基因序列是：Ⅰ型登革病毒标准株EF508198.1、Ⅱ型登革病毒标准株EU249523.1、Ⅲ型登革病毒标准株G...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙强明，邱丽娟，赵玉娇，席珏敏，王晓丹，陈俊英，潘玥，叶超，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学生物学研究所，
类型：发明
国别省市：云南,53