一种重组逆转录病毒载体及其用途制造技术

本发明专利技术公开了一种重组逆转录病毒载体，它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和2所示。本发明专利技术还公开了重组逆转录病毒载体的用途。本发明专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因转染哺乳细胞，转染的比例高，外源基因的表达水平高，且外源基因的表达水平可以持续稳定高产，采用本发明专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程领域，具体涉及一种逆转录病毒载体及其用途。
技术介绍
哺乳动物细胞是重组蛋白药物生产的主要表达系统。目前，采用哺乳动物细胞表达系统生产的生物技术药物已超过全球生物技术药物销售份额的70％。在以哺乳动物细胞为生产系统的重组蛋白药物的生产中，获得高效、稳定表达外源目的蛋白的细胞株在整个生产过程中具有重要的地位。而建立一个重组蛋白高表达细胞株的主要影响因素有：外源基因在染色质中的整合位置；外源基因的拷贝数及其表达载体的表达效率。因此，建立一株高表达细胞株，首先将外源基因整合在宿主细胞染色体转录活跃区域。外源基因在宿主细胞中的整合位点，不但对外源基因表达水平影响很大，而且也影响随后进行的外源基因的扩增效果，以及外源基因在宿主细胞表达的稳定性。哺乳动物细胞的基因组非常庞大，其中包含为数众多的外源基因整合位点，如CHO细胞基因组中大概有15000个整合位点，但其中能使外源基因高效表达的转录活跃位点为数不多，大约有15-30个位点，通常的质粒转染等方法只能将外源目的基因随机整合到宿主细胞基因组内，要想获得高表达的细胞株必须经过大量的筛选，但是获得高效表达外源目的基因的细胞株的几率仍非常低。其次增加外源基因的拷贝数，单拷贝或低拷贝外源基因，无论表达载体调控元件如何强大高效，整合在染色体上的位点多么活跃，其外源基因表达量都是有限的，因此增加外源基因拷贝数对于外源基因的高表达是有效而重要的方法。由于插入位置无特异性，采用质粒转染等其他传统的外源基因介导方法，获得高效表达外源基因细胞系的难度大，几率小。而逆转录病毒载体携带的外源目的基因整合到宿主细胞时，具有倾向发生于染色体开放区和转录活跃位点的明显特点，因此，采用逆转录病毒表达系统可以大大提高获得高效表达外源基因细胞系的几率。比如，许建等，“基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用”，中国人民解放军军事医学科学院，细胞生物学，2008，硕士公开了逆转录病毒PQCXIN获得的EGFP阳性细胞的相对荧光强度约为pcDNA3.1/EGFP质粒转染的EGFP阳性细胞的相对荧光强度的2倍，说明采用逆转录病毒载体PQCXIN比质粒更容易获得高效表达外源基因细胞系，但是，提高幅度不大，有待进一步提升。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种重组逆转录病毒载体，其是在逆转录病毒载体PQCXIN上改进得到的载体PQCEDHFR。本专利技术重组逆转录病毒载体PQCEDHFR，它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQNO：1和2所示。优选地，所述重组逆转录病毒载体PQCEDHFR的核苷酸序列如SEQNO：3所示。本专利技术还提供了一种携带外源基因的转染载体，它是携带有外源基因的重组逆转录病毒载体PQCEDHFR。其中，所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。优选地，所述携带外源基因的转染载体的核苷酸序列如SEQNO：5或6所示。EGFP基因：增强绿色荧光蛋白基因。TNK-tpa基因：组织型纤溶酶原激活剂突变体基因。本专利技术还提供了前述的重组逆转录病毒载体在制备表达外源基因的转基因细胞中的用途。优选地，所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。优选地，所述细胞是哺乳动物细胞。优选地，所述哺乳动物细胞是CHO、BHK、HEK293、NS0、PERC6细胞。本专利技术还提供了一种制备表达外源基因的转基因细胞的方法，步骤如下：(1)取前述重组逆转录病毒载体，连接外源基因，得携带有外源基因重组逆转录病毒载体；(2)取携带有外源基因重组逆转录病毒载体，制备病毒，再感染目的细胞即可。采用本专利技术重组逆转录病毒载体PQCEDHFR携带外源基因(如，EGFP基因或者TNK-tpa基因)转染哺乳细胞(如，CHO细胞)，转染的比例高，外源基因的表达水平稳定，且外源基因的表达水平高，是传统质粒pcDNA3.1的13.3倍，也是改进前的逆转录病毒载体PQCXIN的6.65倍，效果大幅度提高，采用本专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR容易筛选到外源基因高表达的细胞株，应用前景良好。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1建逆转录病毒载体PQCEDHFR及PQCEDHFREGFP和PQCEDHFRTNK-tpa的载体图；图2构建pcDNA3.1/DHFR及pcDNA3.1/DHFR/EGFP和pcDNA3.1/dhfr/TNK-tpa的载体图；图3不同载体表达EGFP的结果比较；图4不同载体表达TNK-tpa的活性比较。具体实施方式实施例1本专利技术逆转录病毒载体的构建如图1所示构建本专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR：取逆转录病毒载体PQCXIN(其结构如图1所示，购自clontech公司)，用酶切位点AgeI(购自NEB公司)和XhoI(购自NEB公司)切除IRES和Neo；通过重叠延伸PCR的方法将IRES和DHFR(序列如SEQNO：1所示)两段基因连接，得基因片段IRESDHFR，在两端设计酶切位点AgeI和XhoI，与PQCXIN用酶切位点AgeI和XhoI切除IRES和Neo后的剩余部分链接，构建得到载体PQCDHFR；利用载体PQCDHFR上的XbaI(购自NEB公司)和NotI(购自NEB公司)酶切位点将启动子CMV替换为PCEF启动子(序列如SEQNO：2所示)，构建得到本专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR，其核苷酸序列如SEQNO：3所示。也可以直接合成SEQNO：3所示核苷酸序列，得到本专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR。实施例2采用本专利技术逆转录病毒载体携带EGFP基因转染细胞一、实验材料本专利技术逆转录病毒载体PQCEDHFR(核苷酸序列如SEQNO：3所示)：按照实施例1的方法制备。对照组质粒：通过常规的分子生物学手段在pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司)用XmaI(购自NEB公司)和BstBI(购自NEB公司)酶切去除筛选基因Neo，连入经同样酶切的DHFR基因，构建成功载体pcDNA3.1/DHFR见附图1和SEQNO：4。二、实验方法在pcDNA3.1/DHFR的EcoRV处连入EGFP报告基因，命名为pcDNA3.1/DHFR/EGFP见附图2，作为对照载体，然后载体PQCEDHFR通过NotI(购自NEB公司)和PacI(购自NEB公司)酶切，连入经同样酶切的EGFP，命名为PQCEDHFR/EGFP见附图1。质粒pcDNA3.1/DHFR/EGFP的转染：转染前24h，6孔板接种2本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组逆转录病毒载体，其特征在于：它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQ NO：1和2所示。

【技术特征摘要】
1.重组逆转录病毒载体，其特征在于：它是将逆转录病毒载体PQCXIN中的筛选基因Neo替换为DHFR基因、启动子CMV替换为启动子PCEF的逆转录病毒载体，其中DHFR基因和启动子PCEF的核苷酸序列分别如SEQNO：1和2所示。2.根据权利要求1所述的重组逆转录病毒载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQNO：3所示。3.一种携带外源基因的转染载体，其特征在于：它是携带有外源基因的权利要求1或2所述的重组逆转录病毒载体。4.根据权利要求3述的转染载体，其特征在于：所述外源基因是EGFP基因或者TNK-tpa基因以及其它外源基因包括细胞因子及蛋白类激素、蛋白酶类、以及免疫球蛋白融合蛋白、单克隆抗体类等生物技术药物。5.根据权利要求4所述的转染载体，其特征在于：其核苷酸序列如SEQNO：5或6所示。...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗世超，李复岁，
申请(专利权)人：四川丰讯科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：四川;51