一种转座载体及其构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了一种转座载体及其制备方法。本发明专利技术所述转座载体融合了PB和SB两种DNA转座子的特性，能够在PB转座酶和SB转座酶条件下转座，同时整合了包括剪接受体、报告基因与真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸加尾序列的基因捕获阅读框，用以在转座过程中实现基因的插入突变，可广泛应用于小鼠、大鼠、猪等哺乳动物的基因突变模型的建立及基因组内大规模基因功能筛选。本发明专利技术所述转座载体还包括loxp位点和Frt位点序列，可以实现转座后近距离DNA片段的条件性敲除，应用于小鼠、大鼠、猪等哺乳动物的大片段DNA序列的条件性缺失模型建立。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体的说是涉及。
技术介绍
转座子，又称转座因子，是转座元件中的一种，具有完整转座元件的功能特征，并能携带内外源基因组片段(单基因或多基因)，在基因组内移动或在生命体之间传播并可表达出新的表型。转座子的转座会使基因组结构和功能改变上有所改变，因而在进化中扮演重要角色。自Mc Clintock在玉米中发现第一个转座子以来，随着对转座子研究的不断深入和技术的日臻完善，转座子已经作为一种重要的基因工程工具，用于多物种的基因组功能和遗传学分析。人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)揭示人类基因组中大约有45%源于转座子，足见转座子在人类基因组进化过程中的影响。然而，长期以来，哺乳动物中由于缺少高效的转座子，其基因操作方面受到很大限制。目前发现的能够在哺乳动物中转座反应的元件有hAT样Tol2转座子、Tcl样转座子和PB (PiggyBac)转座子家族，其中Tcl样转座子包括SB (Sle印ing Beauty) ^P FP (Frog Prince)。这其中SB和PB是目前在哺乳动物应用最为广泛的两种DNA转座子。SB是通过与Tcl家族转座子序列比对，并从鲑鱼(salmanoid)基因组分离重建出的一种Tcl/mariner样转座子，它是第一个能够在哺乳动物细胞中转座的DNA转座元件。 SB转座系统主要包括转座酶合成基因和一能够被转座酶识别的具有反向重复序列的转座元件。SB发生转座时须2个组成部分同时存在。PB分离于甘蓝蠖度尺蛾(Callage Iooper moth Trichoplusia ni)，各方面明显不同于已发现的转座子类型，属于一新转座子家族。 最初PB发现能够在果蝇和昆虫中转座，通过序列比对和功能重建，发现PB还能够在哺乳动物细胞以及生殖细胞转座。PB转座系统的转座也需要转座子序列和转座酶同时存在。SB和PB作为DNA转座子，具有相似的转座机制，但由于来源不同及本身的特性不同，二者之间也存在多方面差异。与PB相比，SB转座酶和转座识别序列的分离构建二元转座系统，提高了转座的安全性。同时SB具有转座子的整合偏好性，更容易插入到供体附近位置，如Kokubu等发现SB转座插入到供体临近的8kb区域内频率更大；Liang等通过 SB和PB的活性比较，发现SB25%的重新整合位点位于次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,Hprt)供体位置白勺4Mb 内，而PB贝Ij 未能表现出这种偏好性。而与SB相比，PB具有更高的转座活性，且转座后供体位置处不留任何足迹，不会造成供体处遗传物质的改变。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术目的是提供一种融合了 SB和PB两种DNA转座子特性的、用于哺乳动物小鼠、大鼠、猪等基因突变的新型转座载体及其构建方法。为实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案一种转座载体，包含以下元件a) PB转座酶识别序列PBL和PBR ；b)原核生物抗性基因；c)复制起始位点序列；d) SB转座酶识别序列SBL和SBR ；e)基因捕获框，所述基因捕获框包括剪接受体、报告基因与真核生物抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸信号序列；所述与报告基因融合的抗性基因与所述转座载体所含抗性基因不同。其中，所述PB转座酶识别序列PBL和PBR分别位于转座子的两端；PB转座酶识别序列PBL与PBR之间依次为原核生物抗性基因、复制起始位点序列、SB转座酶识别序列 SBL、剪接受体、报告基因与真核生物抗性基因的融合基因、SV40的多聚腺苷酸信号序列和 SB转座酶识别序列SBR。本专利技术所述转座载体包含PB转座酶识别序列PBL和PBR和SB转座酶识别序列SBL 与SBR，融合了 PB和SB两种DNA转座子的特性，兼具了 PB的高转座活性和SB近距离转座偏好性，保证转座载体能够在PB转座酶和SB转座酶条件下转座。其中，所述PB转座酶识别序列PBL具有SEQ ID NO :1所示核苷酸序列，所述PB转座酶识别序列PBR具有SEQ ID NO :2所示核苷酸序列，所述SB转座酶识别序列SBL具有SEQ ID NO :3所示核苷酸序列，所述SB转座酶识别序列SBR具有SEQ ID NO 4所示核苷酸序列。复制起始序列为原核生物基因质粒的复制起始位点，是四个高度保守的19bp组成的正向重复序列，本专利技术所述转座载体中包含复制起始序列，用于功能载体的原核生物内的扩增。其中，所述复制起始序列具有SEQ IDNO :5所示核苷酸序列。抗性基因可赋予宿主细胞对某些物质的抗性，直接用于选择转化子。本专利技术所述原核生物抗性基因用于转化子的筛选，可以为本领域技术人员熟知的任意一种抗性基因， 所述抗性基因可以为抗生素抗性基因、重金属抗性基因或代谢抗性基因，其中，以抗生素抗性基因使用最广泛。因此，本专利技术所述原核生物抗性基因。优选为抗生素抗性基因。抗生素抗性基因常常赋予宿主细胞对抗生素产生抗性，而抗生素往往对宿主细胞是致死的。抗生素抗性基因包括原核生物中的氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、四环素抗性基因(Tcr)、氯霉素抗性基因(Cmr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)等。在具体实施方式中，所述原核生物抗性基因为具有SEQ ID NO :6所示核苷酸序列的氨苄青霉素抗性基因。在一些实施例中，氨苄青霉素抗性基因也可为其他抗性基因如氯霉素抗性基因所代替。在一些实施例中，氨苄青霉素抗性基因也可为其他具有可筛选特点的基因片段所代替，如铜抗性基因 (Cur)，胸苷激酶基因(TK)。本专利技术所述转座载体中还整合了包括剪接受体、报告基因与抗性基因的融合基因和SV40的多聚腺苷酸信号序列的基因捕获框，可以实现在高效转座，并且在转座过程中插入基因内部，实现基因的插入突变。本专利技术所述与报告基因融合的真核生物抗性基因可用于插入突变的筛选和插入基因启动子驱动报告基因的表达，保证载体插入宿主基因内部的细胞克隆在G418存在下被筛选保留，可以为本领域技术人员熟知的任意一种真核生物抗性基因，如潮霉素抗性基因(Hygr)、新霉素抗性基因(Neor)等。在具体实施方式中，本专利技术所述与报告基因融合的真核生物抗性基因为新霉素抗性基因。在一些实施例中，新霉素抗性基因也可为潮霉素抗性基因所代替。报告基因(importer gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达，筛选得到转化体。报告基因已被广泛应用于动、植物基因表达调控的研究。目前在动物基因工程研究领域，常用的报告基因有半乳糖苷酶基因(LacZ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。在具体实施方式中，本专利技术所述报告基因为所述半乳糖苷酶基因，半乳糖苷酶基因与新霉素抗性基因融合得到具有SEQ ID NO :7所示核苷酸序列的β-geo基因，表达β-半乳糖苷酶基因与新霉素抗性基因的融合蛋白，同时具有两种蛋白质的特性，可用G418进行筛选，也可用X-gal染色鉴定阳性克隆。剪接受体(s本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种转座载体，其特征在于，包含以下元件：ａ）ＰＢ转座酶识别序列ＰＢＬ和ＰＢＲ；ｂ）原核生物抗性基因；ｃ）复制起始位点序列；ｄ）ＳＢ转座酶识别序列ＳＢＬ和ＳＢＲ；ｅ）基因捕获框，所述基因捕获框包括剪接受体、报告基因与真核生物抗性基因的融合基因和ＳＶ４０的多聚腺苷酸加尾序列；所述与报告基因融合的抗性基因与所述转座载体所含抗性基因不同；其中，所述ＰＢ转座酶识别序列ＰＢＬ和ＰＢＲ分别位于转座子的两端；ＰＢ转座酶识别序列ＰＢＬ与ＰＢＲ之间依次为原核生物抗性基因、复制起始位点序列、ＳＢ转座酶识别序列ＳＢＬ、剪接受体、报告基因与真核生物抗性基因的融合基因、ＳＶ４０的多聚腺苷酸加尾序列和ＳＢ转座酶识别序列ＳＢＲ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张连峰，马元武，全雄志，王贵利，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：11