本发明专利技术公开了一种四环素可控内皮细胞特异性可视化表达目的基因的系统。本发明专利技术提供了用于在猪血管内皮细胞中表达外源蛋白的编码基因的表达盒组合物，由表达盒甲和表达盒乙组成；表达盒甲和表达盒乙均为双链DNA；表达盒甲自上游至下游依次包括ICAM-2启动子、反式四环素转录激活蛋白的编码基因和终止序列；表达盒乙自上游至下游依次包括TRE调控元件、IRES2、荧光标记蛋白的编码基因和终止序列。本发明专利技术提供的系统可用于时空特异性表达外源蛋白。空间特异性是指控制外源蛋白在血管内皮细胞内特异表达。时间特异性是指通过强力霉素控制外源蛋白在特定时间表达。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及动物基因工程领域，具体涉及一种四环素可控内皮细胞特异性可视化表达目的基因的系统。
技术介绍
在异种移植后几天至几周内移植物丧失活性的过程称为延缓性排斥反应(DXR)。 异种移植延缓性排斥反应的两个重要特征是血管内皮细胞激活和单个细胞(单核-巨噬细胞和NK细胞)的浸润。血管内皮细胞作为异种移植三大免疫学屏障之一，在正常情况下，它是一个连续、 平滑的，沿血管方向稳定而静息排列的单细胞层，通过整合素的异二聚体α 2β 1和α 5β 1 连接并维持其完整性，其生理功能主要是阻止血液中的细胞和蛋白等成分向器官和组织外渗漏，并向它们运送营养成分，维持和调节血管张力，维持内皮细胞表面抗凝血活性，分泌和调节血管活性因子，在止血、局部免疫反应和炎症反应调节、血管损伤的保护过程中起中心作用。内皮细胞的激活以IL-I α、E选择素和TF基因等标志性基因表达增加为特征，分为I型和II型内皮细胞激活。I型内皮细胞激活主要是由异种反应性抗体与α Gal抗原相互作用引起，其特征内皮细胞功能受损，直接引起HAR的发生。II型内皮细胞激活是以内皮细胞出现新功能为特征，与DXR的发生相关，主要造成两个生理学效应其一是内皮细胞表达大量促炎症因子，包括E选择素(E-selectin)，细胞间黏附分子-I(ICAM-I)及血管细胞黏附分子-I(VCAM-I)等，其二是通过相关的基因使得促凝血的组织因子(TF)和其它血栓形成调节因子的表达增加，以及血栓调节蛋白的丢失而产生促凝血环境，这两种效应都被认为是由NF κ B介导的转录激活造成的。因此，目前认为通过对供体器官内皮细胞NF-κ B 的抑制，从而抑制内皮细胞的活化，是较好的抑制D)(R的途径。NF- κ B存在于几乎所有类型的组织和细胞，是一类关键性的核转录因子，并构成核转录因子NF κ B家族，哺乳动物中该家族的五位成员分别是NF κ Bl (p50), NF κ B2 (ρ52， ρ49，ρ50Β)，RelA(p65)，c-Rel, RelB。所有成员都含有一个保守的由300个氨基酸组成的 Rel同源区(RHD)，该同源区是NF κ B蛋白的功能域，负责形成二聚体，并与DNA及抑制蛋白 lKB(inhibit κΒ)结合。在内皮细胞中NF-kB的存在形式为p65和c-REL异源二聚体。 一般认为P65是NF- κ B最重要的亚基，具有最广泛的转录活性。因此抑制p65亚基的转录活性，可在很大程度上抑制NF-K B的激活。p65RHD是将p65蛋白羧基端的转录激活结构域(TAD)截去而获得的截短型蛋白，可与p65竞争特定转录因子结合位点，被证明是有效的 NF-K B抑制因子。由于NF-κ B在动物个体生长发育及免疫反应中的重要作用，全身性地持续抑制其功能是不合适的。近年来，内皮细胞保护日益受到学界重视，例如组织因子通路抑制剂(TFPI)、抗凝血酶III等基因在猪内皮细胞中的表达可有效抑制凝血形成。但是，转基因的全身性表达或持续表达仍具有潜在的不良后果。因此实现转入基因在猪的血管内皮细胞中的组织特异性可控表达对于抑制异种移植排斥反应、减缓血管内凝血等后续症状意义重大。四环素可控表达系统(Tet-On Advanced)可实现特定基因的可控表达。该系统由两个载体组成，其中PTet-On Advanced载体表达反式四环素转录激活蛋白(rtTA)， pTRE-Tight载体的目的基因启动子区(又称TRE调控元件或反式激活因子应答元件)由四环素抗性操纵子(Tet 0)和CMV基本启动子组成，rtTA只有在配体强力霉素(DOX)存在时才能结合到Tet 0，从而诱导目的基因的表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种四环素可控内皮细胞特异性可视化表达目的基因的系统。本专利技术提供了用于在猪血管内皮细胞中表达外源蛋白的编码基因的表达盒组合物，由表达盒甲和表达盒乙组成；所述表达盒甲和所述表达盒乙均为双链DNA ；所述表达盒甲自上游至下游依次包括ICAM-2启动子、反式四环素转录激活蛋白 (rtTA)的编码基因和终止序列；所述表达盒乙自上游至下游依次包括TRE调控元件、所述外源蛋白的编码基因、 IRES2、荧光标记蛋白的编码基因和终止序列；所述ICAM-2启动子为如下(1)或(2)或(3)或⑷或(5)(1)第一内含子和基础启动子形成的融合DNA(第一内含子+基础启动子)；(2)基础启动子；(3)基础启动子和第一内含子形成的融合DNA(基础启动子+第一内含子)；(4)第一内含子的反向序列和基础启动子形成的融合DNA(第一内含子的反向序列+基础启动子)；(5)基础启动子和第一内含子的反向序列形成的融合DNA(基础启动子+第一内含子的反向序列)；所述⑴至(5)中，所述第一内含子为如下⑴至(III)中任一所述的DNA分子(I)序列表中序列1自5，末端第58至1513位核苷酸所示的DNA分子；(II)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(III)与(I)或(II)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA 分子；所述(1)至(5)中，所述基础启动子为如下(IV)至(VI)中任一所述的DNA分子(IV)序列表中序列1自5，末端第1514至2399位核苷酸所示的DNA分子；(V)在严格条件下与(IV)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(VI)与(IV)或(V)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA 分子；所述反式四环素转录激活蛋白为如下(a)或(b)(a)由序列表中序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列4的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列4衍生的蛋白质；所述TRE调控元件为如下(VII)至(IX)中任一所述的DNA分子(VII)序列表中序列2自5’末端第12至333位核苷酸所示的DNA分子；(VIII)在严格条件下与(VII)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(IX)与(VII)或(VIII)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的 DNA分子；所述IRES2为如下⑴至(XII)中任一所述的DNA分子(X)序列表中序列2自5’末端第1353至1937位核苷酸所示的DNA分子；(XI)在严格条件下与⑴限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；(XII)与⑴或(XI)限定的DNA序列具有90%以上同源性且具有相同功能的DNA 分子。所述ICAM-2启动子可为序列表中序列1自5’末端第58至2399位核苷酸所示的 DNA分子。所述荧光标记蛋白可为如下(C)或(d)(c)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列5衍生的蛋白质。所述表达盒甲中的所述终止序列具体可为序列表的序列1中自5’末端第3184至 3617位核苷酸所示的DNA。所述表达盒乙中的所述终止序列具体可为序列表的序列2中自5’末端第沈61至 2864位核苷酸所示的DNA。所述反式四环素转录激活蛋白的编码基因具体可为如下①至③中任一所述的DNA 分子①序列表中序列1自5，末端第M本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．用于在猪血管内皮细胞中表达外源蛋白的编码基因的表达盒组合物，由表达盒甲和表达盒乙组成；所述表达盒甲和所述表达盒乙均为双链ＤＮＡ；所述表达盒甲自上游至下游依次包括ＩＣＡＭ－２启动子、反式四环素转录激活蛋白的编码基因和终止序列；所述表达盒乙自上游至下游依次包括ＴＲＥ调控元件、所述外源蛋白的编码基因、ＩＲＥＳ２、荧光标记蛋白的编码基因和终止序列；所述ＩＣＡＭ－２启动子为如下（１）或（２）或（３）或（４）或（５）：（１）第一内含子和基础启动子形成的融合ＤＮＡ；（２）基础启动子；（３）基础启动子和第一内含子形成的融合ＤＮＡ；（４）第一内含子的反向序列和基础启动子形成的融合ＤＮＡ；（５）基础启动子和第一内含子的反向序列形成的融合ＤＮＡ；所述（１）至（５）中，所述第一内含子为如下（Ｉ）至（ＩＩＩ）中任一所述的ＤＮＡ分子：（Ｉ）序列表中序列１自５’末端第５８至１５１３位核苷酸所示的ＤＮＡ分子；（ＩＩ）在严格条件下与（Ｉ）限定的ＤＮＡ序列杂交且具有相同功能的ＤＮＡ分子；（ＩＩＩ）与（Ｉ）或（ＩＩ）限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性且具有相同功能的ＤＮＡ分子；所述（１）至（５）中，所述基础启动子为如下（ＩＶ）至（ＶＩ）中任一所述的ＤＮＡ分子：（ＩＶ）序列表中序列１自５’末端第１５１４至２３９９位核苷酸所示的ＤＮＡ分子；（Ｖ）在严格条件下与（ＩＶ）限定的ＤＮＡ序列杂交且具有相同功能的ＤＮＡ分子；（ＶＩ）与（ＩＶ）或（Ｖ）限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性且具有相同功能的ＤＮＡ分子；所述反式四环素转录激活蛋白为如下（ａ）或（ｂ）：（ａ）由序列表中序列４所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列４的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由序列４衍生的蛋白质；所述ＴＲＥ调控元件为如下（ＶＩＩ）至（ＩＸ）中任一所述的ＤＮＡ分子：（ＶＩＩ）序列表中序列２自５’末端第１２至３３３位核苷酸所示的ＤＮＡ分子；（ＶＩＩＩ）在严格条件下与（ＶＩＩ）限定的ＤＮＡ序列杂交且具有相同功能的ＤＮＡ分子；（ＩＸ）与（ＶＩＩ）或（ＶＩＩＩ）限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性且具有相同功能的ＤＮＡ分子；所述ＩＲＥＳ２为如下（Ｘ）至（ＸＩＩ）中任一所述的ＤＮＡ分子：（Ｘ）序列表中序列２自５’末端第１３５３至１９３７位核苷酸所示的ＤＮＡ分子；（ＸＩ）在严格条件下与（Ｘ）限定的ＤＮＡ序列杂交且具有相同功能的ＤＮＡ分子；（ＸＩＩ）与（Ｘ）或（ＸＩ）限定的ＤＮＡ序列具有９０％以上同源性且具有相同功能的ＤＮＡ分子。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨述林，李和刚，桂端，李奎，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：11
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。