基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上5

【技术实现步骤摘要】
基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学检验领域，具体涉及一种基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针及方法。

技术介绍

[0002]小鼠微小病毒(MVM)是目前动物病毒中最小最简单的单链DNA病毒之一，属于细小病毒科，细小病毒属。小鼠感染MVM病毒虽无明显的临床症状但可对一些免疫、移植和肿瘤等实验的结果造成严重的干扰。无论是在国外的FELESA、Charles River等大型检测实验室的实验小鼠健康监测的指南中还是国内关于实验动物检测的国标中均明确了MVM病毒的检测为实验小鼠的必检项目。目前常见的MVM检测方法包括血清学检测技术IFA、ELIS A法、分子病原学PCR、qPCR法等，也有一些新的病原分子核酸检测技术如环介导等温扩增技术(LAMP)等。血清学等回顾性检测适用于病毒感染后的检测，但是对免疫功能低下或免疫缺陷小鼠(如SCID小鼠和裸小鼠等)进行抗体检测，不能反映出动物感染病原的真实情况；PCR和qPCR等分子病原学检测技术识别病原，但耗时相对较长，对程序控温仪器有要求，不适合现场检测；LAMP虽然灵敏度高但其引物设计复杂繁琐，难度较大。因此建立一种快速简单并准确的检测技术十分必要。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题为：如何提供一种快速简单准确的检测小鼠微小病毒的方法。
[0004]本专利技术的技术方案为：基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针组合，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上5
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端第34位碱基标记发光基团，第36位碱基替换为THF，第38为碱基标记淬灭基团，3
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端用阻断剂标记。
[0005]进一步地，所述发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，阻断剂为C3 spacer。
[0006]基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物和探针组合。
[0007]进一步地，还包括RAA荧光通用反应试剂、反应缓冲液、阴性指控品、阳性指控品中的一种或多种。
[0008]基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的方法，包括如下步骤：
[0009](1)提取待检测样本的基因组DNA；
[0010](2)以提取的基因组DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物和探针组合进行RAA扩增，检测荧光信号；
[0011](3)通过荧光信号进行结果判定。
[0012]参照NCBI上发表的MVM基因组序列，经BLAST比对，本专利技术选择保守性高、具有代表性的NS1基因片段设计检测引物和探针，具有高度特异性，保证了检测的准确性。灵敏度与
传统的荧光定量PCR方法相当。实际样本和核酸模拟样本的验证研究证实本研究建立的实时荧光RAA检测方法具有与传统荧光定量PCR方法一致的稳定性和可靠性，两种方法的检测符合率为100％。与传统荧光定量PCR方法相比，本专利技术建立的实时荧光RAA检测方法的检测周期极短(包括结果判读在内，仅需20～30min)、操作也相对更加简单。
[0013]与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
[0014]本专利技术针对MVM病毒所建立的荧光RAA检测方法具有快速方便、灵敏度高、特异性强等优点。
附图说明
[0015]图1普通RAA法引物筛选；
[0016]图2荧光RAA法的特异性试验结果；
[0017]图3MVM病毒qPCR法和荧光RAA法的灵敏度，A:qPCR法、B:荧光RAA法；图中1～5表示105～101copies/μL，6阴性对照；
[0018]图4MVM的小鼠样本检测结果：荧光RAA检测时间(Tt)和qPCR检测周期(Ct)间的线性回归分析。
具体实施方式
[0019]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
[0020]1材料与方法
[0021]1.1实验动物
[0022]45只SPF级BALB/C小鼠，雄性，6周龄来自于北京维通利华实验动物技术有限公司[SYXK(京)2022
‑
0052]。
[0023]1.2病毒
[0024]小鼠微小病毒(MVM)、小鼠肝炎A59型(MHV
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A59)，小鼠肝炎1型(MHV
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1)，小鼠肝炎3型(MHV
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3)，小鼠肝炎JHM型(MHV
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JHM)，小鼠呼肠孤病毒3型(Reo
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3)本单位保存。
[0025]1.3主要试剂与仪器
[0026]Takara MiniBEST Viral RNA/DNA提取试剂盒(批号：ALG0523A)购自宝日医生物工程(大连)有限公司；Probe dPCR Mix(批号：ALF2404A)均购自北京六合通经贸有限公司；ZC
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Basic kits，ZC
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exo kits(批号：84822012)和ZC
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RT
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exo kits(批号：83833013)购自杭州众测生物有限公司；核酸抽提液(批号：20180426)购自北京索莱宝生物科技有限公司；1
×
TE缓冲液(批号：H421KA9723)购自生工生物工程股份有限公司；DMEM培养基(批号：AH29820716)购自美国丹纳赫集团；ABI7500荧光定量PCR仪购自美国应用生物系统公司(ABI)；NanoDrop 2000C超微量分光光度计购自美国Thermo Scientific公司。
[0027]1.4实验方法
[0028]1.4.1核酸提取
[0029]本文提到的病毒和小鼠盲肠内容物的核酸均使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa，大连，中国)提取，按照制造商的说明操作提
取。
[0030]1.4.2引物和探针的设计
[0031]依据NCBI上发表的MVM(NC_001510)基因组序列，经BLAST比对选择MVM高度保守区域NS1基因设计引物和探针，见表1和表2。所有引物探针均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0032]1.4.3qPCR反应体系及反应条件
[0033]qPCR反应采用ABI 7500荧光仪进行。qPCR反应体系为：2X Premix Ex Taq(Probe qPCR)10μL,PCR Forward Primer(10μM)0.4μL,PCR Reverse Primer(10μM)0.4μL,Probe 0.8μL,ROX Reference DyeⅡ(50X)0.2μL,DNA模本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基于荧光RAA检测小鼠微小病毒的引物和探针组合，其特征在于，所述引物包括正向引物和反向引物，正向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，探针是在SEQ ID No.3所示核苷酸序列的基础上在5
’
端第34位碱基标记发光基团，第36位碱基替换为THF，第38为碱基标记淬灭基团，3
’
端用阻断剂标记。2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述发光基团为FAM，淬灭基团为BHQ1，...

【专利技术属性】
技术研发人员：向志光，赵晓瑜，郭建国，魏强，
申请(专利权)人：中国医学科学院医学实验动物研究所，
类型：发明
国别省市：